细胞色素P450与蚊虫抗药性的关系

摘  要：本文综述了在杀虫剂抗性中起重要作用的细胞色素P450酶系在蚊虫中研究的最新进展。抗性问题给疾病的虫媒控制工作带来了巨大的障碍，而抗性的产生往往与某些P450的诱导和过量表达有关。对P450基因表达与功能研究的深入，必将为蚊虫的可持续控制提供新的思路。     关键词：细胞色素P450；蚊虫；抗药性

细胞色素P450是广泛分布于动物、植物及微生物等不同生物体内的一种重要的代谢酶系，它位于某些细胞的光滑内质网上，是多功能氧化酶(MFO)的重要组成成分。可诱导性是细胞色素P450酶系的重要特征，一些内源性物质和外源性物质包括激素、类固醇、脂肪酸、药物、植物次生性化合物以及一些杀虫剂能够诱导生成不同形式的细胞色素P450酶，使昆虫通过诱导作用，增加解毒酶的含量，从而大大增强其自我保护和对外界环境的适应能力(黄俊勇和冷欣夫，1991)。       蚊虫是与人类生活密切相关的重要医学昆虫之一，其分布范围广，传播多种疾病(如霍乱、登革热等)，给生活环境、人体健康带来许多负面影响。长期单纯的化学防治手段导致了蚊虫抗药性的大大提高。从而给疾病的虫媒控制工作带来了很大的障碍(Scott JG et al. 2001)。而P450介导的杀虫剂代谢解毒作用的增强是昆虫抗药性产生的普遍机制，且往往是大多数重要害虫对杀虫剂产生高水平抗性和交互抗性的主要原因(Scott JG et al. 2001)。因此了解蚊虫细胞色素P450的诱导及作用机制及其与抗药性的关系，对于认识细胞色素P450参与的杀虫剂抗性的发生发展机制和指导病媒防治具有重要意义。       1. 蚊虫抗药性现状       双翅目卫生害虫的抗药性现象是普遍而严重的。目前除了舌蝇外，几乎所有卫生害虫都有抗性报道(郝强等，2002)。据蒋国民等(1996)的数据报道，害虫对有机氯杀虫剂的抗性倍数数以千计；对有机磷杀虫剂的抗药性倍数数以百计；而拟除虫菊酯类药剂虽然使用的历史不是很长，抗性也达到了数千倍。      拟除虫菊酯类杀虫剂约占全球杀虫剂市场的25% (Hemingway, 2004)，由于其低毒、高效、底残留，被广泛用于蚊虫的防治工作中。尽管不同种类的拟除虫菊酯类杀虫剂在功能上有所区别，但总的来说，该类杀虫剂都能达到高效的刺激和击倒作用(Hougard et al., 2002)。比如毕芬宁(bifenthrin)比溴氰菊酯(deltamethrin)的刺激作用要小的多，因而蚊子可以在经毕芬宁处理后的材料上多待一会儿时间，因而蚊子所沾染的杀虫剂剂量就会相对比较高一些。尽管蚊虫对天然拟除虫菊酯的抗性发展缓慢，但对人工合成的拟除虫菊酯药剂的抗药性发展速度却快于有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂(刘维德，1990)。除此之外，许多研究证实，蚊虫蚊虫极易对拟除虫菊酯类杀虫剂产生交互抗性。对一种拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的媒介昆虫，对其它拟除虫菊酯类杀虫剂或类似物也有抗性作用(Curtis, 1993)。姜家良(1984)在实验室曾用苄呋菊酯选育淡色库蚊，发现该品系对十多种不同拟除虫菊酯都有不同程度的抗性。张朝远等(1992)报告了抗氰戊菊酯淡色库蚊品系对多种拟除虫菊酯类杀虫剂都产生一定程度的交互抗性。刘凤梅等(1998)用氯氰菊酯选育淡色库蚊幼虫，使抗性达514.55倍的抗性品系，对溴氰菊酯交互抗性达85.85倍，明显高于对非菊酯类杀虫剂的交互抗性。对一种杀虫剂产生高抗性后，会大大影响许多同类杀虫剂的实用价值，可见各种拟除虫菊酯之间不能取代。也就是说用百灭宁permethrin和毕芬宁之类的新型菊酯类杀虫剂防治蚊虫，其高效的防治效果不会持续太长时间(Chandre et al., 1999)。自从拟除虫菊酯类杀虫剂成为控制疟疾的蚊媒的唯一选择后(Hemingway等, 2004)，该类杀虫剂有效发挥控虫效果的持续时间也越来越受到了人们的重视。       2. 细胞色素P450       细胞色素P450单加氧酶系是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其他外源性和内源性化合物代谢的主要解毒酶系。细胞色素P450是细胞色素P450单加氧酶系的末端氧化酶，起着与底物结合以及从NADPH传递电子到NADPH细胞色素P450还原酶的重要作用(Nekson et al., 1993)。       2.1抗性相关的细胞色素P450家族       细胞色素P450功能的多样性是由其结构的多样性决定的。由于P450存在大量异构体，具有多种的表达方式，并且其底物范围宽广，因此P450的具体类型多种多样(Scott and Wen, 2001; Feyereisen, 1999)。细胞色素P450基因的表达调控十分复杂，涉及多个因素的相互作用，同时由于P450蛋白酶分离、纯化单一组分十分困难，因而鉴定抗性相关的昆虫P450基因的工作是非常困难的。目前已知昆虫基因组中携带有近100个P450基因，它们成簇或散布在各染色体上，每一个基因编码一种不同的P450酶(陈秋霞，2001)。       已鉴定的昆虫P450家族中，一般认为CYP6家族与杀虫剂抗性有关，比较肯定的如CYP6DI、CYP6A1、CYP6A2等(Liu, and Scolt, 1997)。Kasai等(2000)认为热带家蚊Culex quinquefasciatus对百灭宁的抗性与CYP6F1相关，Rongnoparut等(2003)研究发现，矮小疟蚊的抗溴氰菊酯品系中，抗性相关的P450为CYP6家族的CYP6AA2。从目前掌握的资料来看，在蚊虫对杀虫剂抗性的产生，不仅仅与CYP6家族有关，在某些种类中，CYP4家族也起了很大的作用(Shen et al.,2003; 朱昌亮等，2000)。朱昌亮等(2000) 采用cDNA芯片技术对编码淡色库蚊P450基因进行分析，结果显示CYP4对淡色库蚊对抗性相关。朱昌亮等(2001) 对淡色库蚊抗溴氰菊酯品系的P450进行进一步的分子系统学研究显示，24个新基因分别属CYP4家族的CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J亚家族。冈比亚按蚊基因组中含有111个P450基因，并且在基因内部大部分呈现簇状排列，分别位于染色体X(10个)、2L(11个)、2R(47个)、3L(11个)、3R(32个)，也以Cyp4和Cyp6两家族成员居多(Ranson et al., 2002a.)。在冈比亚按蚊基因的报道之前(Holt et al., 2002)，Ranson等(2002b)已经鉴定了34个P450基因。Nikou等(2003)从抗百灭宁的冈比亚按蚊种鉴定出2个抗性相关的主要QTL(quantitative trait loci)，分别位于染色体3R臂和染色体2L臂的上，并认为这两个QTL上存在许多P450相关基因。       2.2 细胞色素P450的诱导       所谓P450的诱导是指某一细胞色素P450的水平能够在暴露于某药物或其它异源物质后显著增加，是化学刺激物通过解毒酶增加而使解毒作用增强的过程(Nebert and Gonzlalez, 1989)。可诱导陆是P450酶系的重要特征。细胞色素P450处于不断合成与降解中，外界物质及生理状况的改变都会影响酶合成量的改变。许多不同结构的化合物，如药剂和植物次生物质都能诱导P450的生物合成(Terriere, 1984)。     细胞色素P450的诱导具有时间效应和剂量效应：只有当诱导剂达到一定浓度和一定作用时间才会发生诱导作用(Terriere, 1984)。细胞色素P450与其它解毒酶能协同诱导，即诱导一种解毒酶的诱导剂可同时诱导其它几种解毒酶。有许多报道指出，在抗性蚊虫中，P450单加氧酶活性的提高，通常与其它酶的活性变化有关。如Vulule等 (1999)报道在肯尼亚，抗百灭宁(Permethrin)的冈比亚按蚊品系中，氧化酶含量和酯酶水平具有上升现象。Brogdon等 (1999a,b)报道在危地马拉，抗百灭宁的冈比亚按蚊品系中存在两种解毒机制，氧化酶解毒机制和酯酶解毒机制，两者或单独发挥作用，或共同起作用。     2.3 细胞色素P450的过量表达      许多研究表明，P450相关的昆虫抗性往往表现为某种P450的过量表达，这是一种普遍的抗性机制 (Feyereisen, 1999; Scott, 1999)。细胞色素P450表达量或酶活性的增加可以通过转录水平、基因水平和翻译水平几个方面实现，其中转录水平主要表现为转录效率增加。基因水平主要表现为结构基因扩增，翻译水平则主要表现为mRNA或蛋白稳定性增加。       Nikou等(2003) 发现在抗拟除虫菊酯的雄性品系中，CYP6Z1的表达量约为敏感品系的11倍，在抗拟除虫菊酯的雌性品系中，CYP6Z1的表达量约为敏感品系的4-5倍。Southern杂交显示，这种过量表达不是因为基因扩增而引起的。朱昌亮等(2000)在研究淡色库蚊Culex pipiens pallensP450抗性相关基因克隆与鉴定时观察到，抗溴氰菊酯品系RT-PCR后获得的2个DNA片段的强度约为敏感品系的10倍；在两次克隆中，抗性品系获得的阳性克隆数多于敏感品系，并且5个克隆出现多拷贝，而敏感品系阳性克隆无一多拷贝发现。矮小疟蚊Anopheles minimus是台湾地区传播疟疾的主要病媒蚊，矮小疟蚊的抗溴氰菊酯品系中CYP6AA2的转录量显著高于敏感品系(Rongnoparut, et al., 2003)。Kasai等(2000)报道了百灭宁抗性品系中Cyp6f1转录水平的上升(约2.5倍)。Shen等(2003)发现抗淡色库蚊抗溴氰菊酯品系中Cyp4系列基因的上调。Kasai等(2000)发现CYP6F1在热带家蚊Culex quinquefasciatus的抗百灭宁品系中具有过量表达现象。       3. 细胞色素P450介导蚊虫抗药性       细胞色素P450对研究蚊虫抗药性提供了许多有实践意义的信息：(1)抗性的产生可能是某一种P450的作用，因此选择该P450的特异性抑制剂可以有效地消除抗性；Chansak和Brattsten (2001)对白纹伊蚊Aedes albopictus的西维因抗性机制进行研究，发现在P450抑制剂(协力精，piperonyl butoxide)存在的情况下，西维因的药效得到加强，实验结果证实了P450同工酶对白纹伊蚊的抗性产生有关。(2)P450的进攻部位可能仅限于某类杀虫剂分子中的某一结构部位，因此换用与该结构有所不同的同类杀虫剂可以有效地杀死害虫；(3) 有些P450的催化作用还需细胞色素b5的参与，细胞色素b5在某些特定反应中充当电子传递物，负责将电子传送给P450 (Nikou et al., 2003)，因此细胞色素b5也可以成为抗性治理的一个靶标。       氨基酸残基改变P450氨基酸残基的改变也可能导致昆虫的抗药性，但这只是一种猜测，尚没有令人信服的证据。Ranson等(2000a,b)发现抗性冈比亚按蚊种的一个密码子发生基因突变，该密码子所编码的蛋白中，亮氨酸被替换成了色氨酸，而该密码子在许多节肢动物中与拟除虫菊酯抗性有关。有研究表明，P450的超量表达可能降低昆虫的适合度，因为超量表达的P450可能同时具有对内源性的激素分子的功能。而氨基酸替换可能对昆虫的适合度影响较小，因此导致抗性的氨基酸替换一旦在种群中固定下来，将可能促进超量表达机制的丧失(Berge et al., 1998)。           4. 结语       蚊虫细胞色素P450基因表达的增高是抗药性形成的原因之一，也是昆虫长期适应环境变化的结果。近年来，随着分子生物学技术的发展与完善，人们分离鉴定的P450组分增多，对特定的P450基因结构和P450表达的认识逐渐深入，这将促进对细胞色素P450的诱导机制和P450基因的表达调控的了解，及其对P450参与抗药性的分子机理的研究。抗性机制的了解是抗性治理的基础。随着更多蚊虫细胞色素P450的功能鉴定，必将为蚊虫的可持续控制提供新的思路。

参 考 文 献

Berge, J. B., Feyereisen, R. and Amichot, M. 1998. Phil. Trans. R. Sco. Lond. B. 353, 1071-1075.     Brogdon, W.G.,  et al., 1999a . Oxidase-based DDT–pyrethroid cross-resistance in Guatemalan Anopheles albimanus. Pestic. Biochem. Physiol. 64,101–111.     Brogdon, W.G., et al., 1999b. Independent selection of multiple mechanisms for pyrethroid     Chandre, F., et al., 1999. Status of pyrethroid resistance in Anopheles gambiae sensu lato. Bull. WHO 77, 230–234.     Chansak, S. and Brattsten, L. B., 2001. Effects of exposure to pesticides on carbaryl toxicity and cytochrome P450 activities in Aedes albopictus larvae (Diptera, Culicidae). Pestic. Biochem. Physiol . 70, 2, 63-73.     Curtis, C. F., 1993. Workshop on bednet at the International Congress of Tropical Medicine. Fapanese Fournal of Sanitary Zoology. 44, 65-68.     Feyereisen, R., 1999. Insect P450 enzymes. Ann. Rev. Entomol. 44, 507–533.     Hemingway, J., et al., 2004. The molecular basis of insecticide resistance in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34, 653–665.     Holt, R.A., et al., 2002. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science 298, 129–149.     Hougard, J.M., Duchon, S., Zaim, M., Guillet, P., 2002. Bifenthrin, a useful pyrethroid insecticide for treatment of mosquito nets. J. Med. Entomol. 39, 526–533.     Kasai . S., et al., 2000. Molecular cloning, nucleotide sequence and gene expression of a cytochrome P450 (CYP 6F 1) from the pyrethroid-resistant mosquito, Culex quinquefasciatus Say. Insect Biochem. Mol. Bio. 30, 163–171.     Liu, N., Scolt, J. G., 1997. Inheritaace of CYP6DI-mediated pyrethroid resistance in house fly (Diptera：Muscidae)．J. Econ. Entomol. 90, 1478-1481.     Nebert, D.W., Gonzlalez, E. J. 1989. P450 genes：structure, evolution, and regulation. Annu. Rev. Biochem. 56, 945-993.     Nekson, D. R., et al., 1993. The P450  superfamily, update on new sequence, gene mapping, accession  numbers, early trivial names of enzyrnes and nomen clature . DNA Cell Biol, 12(1),1-51.     Nikou, D., Ranson, H., Hemingway, J., 2003. An adult-specific CYP6 P450 gene is over expressed in a pyrethroid-resistant strain of the malaria vector, Anopheles gambiae. Gene 318, 91—102.     Ranson, H., et al., 2002a . Evolution of supergene families associated with insecticide resistance. Science 298, 179–181. Ranson, H., et al., 2002b. Molecular analysis of multiple cytochrome P450 genes from the malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 11, 409418.     Ranson, H., et al., 2004. Genetic mapping of genes conferring permethrin resistance in the malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. Submitted for publication.     resistance in Guatemalan Anopheles albimanus (Diptera, Culicidae). J. Econ. Entomol. 92, 298–302.     Rongnoparut, P., et al., 2003. Cloning of cytochrome P450, CYP6P5, and CYP6AA2 from Anopheles minimus resistant to deltamethrin.  J. Vect. Ecol.  28(2), 150-158.     Scott, J.G., 1999. Cytochromes P450 and insecticide resistance. Insect Biochem. Mol. Biol. 29, 757–777.     Scott, J.G., Wen, Z., 2001. Cytochromes p450 of insects, the tip of the iceberg. Pest . Manag. Sci. 57, 958–967.     Shen, B., et al., 2003. Cytochrome P450 genes expressed in the deltamethrin-susceptible and -resistant strains of Culex pipiens pallens. Pestic. Biochem. Physiol. 75, 1-2, 19-26.     Terriere, L. C., 1984. Induction of detoxication enzymes in insect. Ann. Rev.Entoml. 29,71-88.     Vulule, J.M., et al., 1999. Elevated oxidase and esterase levels associated with permethrin tolerance in Anopheles gambiae from Kenyan villages using permethrin-impregnated nets. Med. Vet. Entomol. 13, 239244.     陈秋霞,2001. 昆虫细胞色素P450的诱导和抗药性. 热带医学杂志.1(1), 67-71.     郝强，梁高健，颜发广，2002. 中华卫生杀虫药械. 8 (1)：54-56.     黄俊勇，冷欣夫，1991． 细胞色素P450酶系的研究进展．昆虫知识．5：308－312.     姜家良,1984. 昆虫对拟除虫菊酯的交互抗性. 四川动物.3(3)：40-44.     蒋国民等，1996. 卫生杀虫药剂、器械及应用手册. 上海：百花出版社. 654-655.     刘凤梅等, 1998. 淡色库蚊抗氯氰菊酯品系对化学杀虫剂交互抗性的研究. 中国公共卫生. 14(7), 433-434.     刘维德, 1990．我国蚊类抗药性发展动向中国媒介生物学及控制杂志. 1(1)：41—43．     张朝远等, 1992. 抗氰戊菊酯淡色库蚊的抗性谱以及增效剂的作用. 中国媒介生物学及控制杂志. 3(2), 65-69.     朱昌亮等, 2001.淡色库蚊细胞色素P450基因研究. 生物化学与生物物理进展. 28(1), 61-66.     朱昌亮等，2000.淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 18(5), 263-268.