保护碱基

nacoo 发表于 2005-11-2 20:10:00 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双 酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加 上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 酶 寡核苷酸序列 链长 切割率% 2 hr 20 hr GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0 Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 >90 >90 0 >90 >90 Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 >90 >90 >90 >90 >90 CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 >90 >90 25 >90 >90 Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0 75 25 0 >90 >90 BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 >90 BstE II GGGT(A/T)ACCC 9 0 10 BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 >90 Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 8 10 12 0 0 >90 50 0 0 >90 50 EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75 Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 >90 >90 0 >90 >90 Mlu I GACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 Nco I CCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75 Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 20 22 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 >90 >90 Nhe I GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 8 10 12 0 10 10 0 25 50 Not I TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 12 16 20 24 28 0 10 10 25 25 0 10 10 90 >90 Nsi I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 12 22 10 >90 >90 >90 Pac I TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 8 10 12 0 0 0 0 25 >90 Pme I GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 8 10 12 24 0 0 0 75 0 25 50 >90 Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 8 14 22 24 26 0 10 >90 >90 0 0 10 >90 >90 0 Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 8 10 12 0 10 0 0 25 10 Sac I CGAGCTCG 8 10 10 Sac II GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 8 12 0 50 0 >90 Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28 30 32 0 10 10 0 50 75 Sca I GAGTACTC AAAAGTACTTTT 8 12 10 75 25 75 Sma I CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 6 8 10 12 0 0 10 >90 10 10 50 >90 Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 8 10 12 14 10 10 0 0 >90 >90 50 50 Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 8 12 14 0 0 10 0 25 50 Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 8 10 12 14 0 >90 75 75 0 >90 >90 >90 Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 8 10 12 0 10 10 0 25 75 Xma I CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 8 10 12 14 0 25 50 >90 0 75 >90 >90 阅读全文(1771) | 回复(1) | 引用通告(0) | 编辑 上一篇：MAIL FROM command failed: 未知 下一篇：2005-11-3之前发布的图片 Re:保护碱基 dean1982li发表评论于2006-2-22 20:53:00 最近忙着准备试验，在涉及引物的时候出现了困惑：（，我是准备做RT-PCR的，然后构建载体。 1、经过分析在载体上出现而没有在我的目的序列里面出现酶切的两个酶是EcoR I和Kpn I， 我准备把这两个酶切位点加在我的引物5‘端，问题是这两个酶切位点可以同时加在同一条引物上面吗？在两个位点之间有没有分隔？保护碱基呢？例如： 保护碱基G,EcoR I是GAATTC，Kpn I是GGTACC，引物是*********** 是否该这样添加？G-GAATTC-GGTACC-*********** 2、上游引物可以如上添加，那么下游引物呢？ 下游引物的酶切位点是和上面的一样还是和上面的互补？因为有的同学说是要按照互补得来的。即 应该 G-CTTAAG-CCATGG-***********，很是奇怪啊，还请指正~~ 3、双酶切是应该把两个酶切位点分别添加在上下游引物的5‘端还是同时将两个酶切位点加在同一条引物上？ 这些我都查了好多资料，还是想不明白