紫外成像高灵敏检测器
摘要:单分子检测开辟了生命科学研究的新方向。许多生物反应和分析可以用以前无法进行的微量样品检测,而单个分子的行为和相互作用即使在其天然的细胞环境中也能够被跟踪。然而,应用范围的这一扩展对检测技术提出了更高的要求,特别是新型检测器必须的两个核心要求:高灵敏度和快速。
A Sensitive Detector for Ultralow-Light Imaging
Colin G. Coates
Abstract: Trends toward single-molecule measurements are opening up new vistas in life science research. Many biological reactions and assays can now be carried out with minute samples, which formerly were insufficient for measurement purposes, and the behavior and interactions of individual biomolecules can be tracked even within their natural cellular environments. However, extending the scope of this work is placing heavy demands on detection technology; specifically, new detectors are needed with two key requirements:
sensitivity and speed.
目前,对单分子检测的研究将低浓度分析引入了一个新时代。生物反应与检测在样品量很小时也能进行,这样的样品量在常规检测中是不能满足需要的,而单个分子的行为和相互作用即使在其天然的细胞环境中也能够被跟踪。此外,诸如细胞内的离子信号显微镜(例如Ca2+ 通量显微镜)和多维(4-5D)显微镜技术对检测技术提出了相当高的要求,这些要求可以从本质上归结为两个核心:高灵敏度和快速。
所采用的光电组件必须足够灵敏,这是因为:1)低染料浓度和单分子弱信号的检测;2)解决曝光时间短造成的光通量较低的问题(补充快速的画面速度);3)检测由于激发能量降低造成的较弱光通量(降低染料褪色和对组织的光损伤并延长时间寿命);4)克服高速输出时的严重噪音对检测限的影响。例如,高画面速度能够促进:1)单个生物分子之间动态相互作用的研究;2)单分子跟踪;3)对单分子瞬闪影响的研究;4)与细胞内离子信号传导研究的大量瞬时分辨要求相一致的快速钙通量过程的记录;5)共焦3- 或4-D 累加的快速Z- 阵列构建。
1 灵敏度 在讨论如何提高灵敏度之前,先对电荷耦合装置(CCDs)[1]和其他检测器灵敏度的性质有所了解是非常重要的。有两个参数显著影响检测灵敏度:量子效率(QE)和系统噪音。量子效率用来衡量光电组件捕获有价值光子的能力,高量子效率意味着在CCD 像素内有更多的光子被转化成光电子。一旦转化完成,在一定像素内的光电子必须超出检测限或光电组件的噪音基线,而这是由系统噪音决定的。增大量子效率和减小噪音将使很弱的信号也能够被检测。
在进行总体的信噪比数值比较时,必须了解单个噪音的影响以确定信号是否能够被检测。最重要的是,信号必须扣除基线噪音。如图1所示,主要的噪音源由弱信号的二维- 线形强度曲线(仅占用有限数量的像素)可以说明。
系统噪音由两部分组成:暗电流噪音和输出噪音。当在背光电子增幅电荷耦合器件(BVEMCCD)(Andor Technology Ltd., Belfast, Ireland)中采用增强的热电冷却后,暗电流基本上被消除(注意,BV是指优化的可见/近红外范围)。这样,光电组件的输出噪音就是真正的检测限,尤其是在快速成像时。输出速度越快(多通道-MHz) 输出噪音越大,例如,在输出速度为5MHz 时,输出噪音大于40 个电子的均方差,输出速度小于1MHz 时这一数值降低到2 个电子的均方差。
短噪音决定信号的定量偏差,反映了测量信号对真实值的波动程度。检测器的短噪音与光强度和检测器量子效率相关。量子效率较高的背光传感器可以获得更高的信号- 短噪音比。原因很简单,短噪音是真实信号的平方根,必须由传感器上的真实光电子数目计算得到,而不是简单由输入的光子数决定。这样,除了信号- 短噪音比较高外,量子效率高的检测器还能够获得相对噪音基线更强的响应信号。