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【本讲教育信息】 一. 教学内容： 微生物的生长及发酵工程
二. 学习内容： 本周学习微生物种群的生长特点，直到生长曲线的绘制以及所代表的意义，理解微生物生长过程中出现的四个时期的原因及其特点。理解连续培养的操作原理及其意义，知道影响微生物生长的各种环境因素。理解发酵工程的概念，掌握发酵工程的基本操作过程，在每一操作过程中要注意的基本问题。了解发酵工程的意义和应用。
三. 学习重点： 1. 微生物群体生长的规律 2. 微生物群体生长规律在生产实践中的应用 3. 温度、PH值、氧气等因素对微生物生长的影响 4. 发酵工程的概念和内容
四. 学习难点： 1. 微生物群体生长规律在生产实践中的应用 2. 发酵过程中如何保证菌种的生长和代谢的正常
五. 学习过程： 微生物的生长 （一）微生物的生长： 单细胞生长：在代谢的基础上，单细胞微生物会由小到大不断地生长，个体的生长很不明显，持续很短时间就开始繁殖，单细胞生物生长和繁殖交替进行，界限难以划清。 研究方法：在实际工作中，常以微生物的群体为单位来研究微生物的生长。
（二）生长规律： 群体生长研究：在人工培养的条件下，将少量的某种细菌接种到恒定容积的液体培养基中，并置于适宜的条件下培养，然后，定期取样测定培养基里的细菌群体的生长情况 测定方法： A. 是测细菌的细胞数目 将待测样品与等量的已知含量的红细胞混匀后，涂布在载玻片上，经固定染色后，在显微镜下随机选若干个视野进行计数，得出细菌与红细胞的比例，再根据红细胞的含量计算出单位体积内的细菌数目 B. 是测重量 取一定体积的培养基，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。 生长曲线：细菌的生长速率并不是始终不变的，而是随时间的推移发生了有规律的变化。 横坐标：时间，纵坐标作：细菌数目的对数，曲线：反映细菌生长规律
生长曲线特点：细菌群体从开始生长到死亡的动态变化可以分为以下四个主要时期 调整期：刚刚接种到培养基上的细菌，对新环境有一个短暂的调整或适应过程 特点： a. 一般不立即开始分裂繁殖 b. 这时细菌的代谢活跃，体积增长较快 c. 大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP以及其他细胞成分 d. 调整期的长短与菌种、培养条件等因素有关 对数期：这个时期的细菌进入快速分裂阶段，细胞数目以等比数列的形式增加 特点： a. 细菌快速分裂，细胞数目以等比数列的形式增加 b. 代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定 c. 常作为生产用的菌种（也叫种子）和科研的材料 稳定期：经过一段时间的高速生长后，细菌的分裂速率下降，整个培养基中细胞数达到动态平衡。 特点： a. 培养基营养物质的消耗，有害代谢产物的积累，pH发生变化等 b. 细菌的分裂速率下降，死亡细胞的数目逐渐增加，活菌数目达到最高峰，培养基中细胞数达到动态平衡。 c. 细胞内大量积累代谢产物，特别是次级代谢产物，某些细菌的芽孢也是在这个时期形成的。 衰亡期：培养继续，细菌的死亡速率超过繁殖速率，最终导致培养基中的活菌数目急剧下降。 特点： a. 细胞出现多种形态，甚至畸形 b. 有些细胞开始解体，释放出代谢产物等
生长曲线的意义： a. 处于对数期的细菌，生长繁殖速率快，代谢旺盛，常作生产用菌种，以缩短生产周期 b. 稳定期时抗生素等代谢产物逐渐增多，适当补充营养物质，延长稳定期、可提高代谢产物的产量 c. 连续培养：在一个流动装置中，以定速度不断地添加新的培养基，同时以同速度不断放出老的培养基，以保证微生物对营养物质的需要，并排出部分有害代谢产物，使微生物保持较长时间的高速生长。 应用：酒精、丙酮、丁醇等产品的生产 优点：缩短了培养周期，提高了设备利用率，并且便于自动化管理
（三）影响生长的外界因素： 温度：一种微生物只能在一定的温度范围内生长 最适生长温度：微生物生长最旺盛时的温度叫最适生长温度。绝大多数微生物的最适生长温度为25～37℃。 特点：在最适生长温度范围内，微生物的生长速率随温度的上升而加快。 超过最适生长温度，生长速率会急剧下降，细胞内蛋白质和核酸等被不可逆的破坏。 pH：每种微生物的最适pH不同 多数细菌的最适pH：6.5～7.5，真菌的最适pH：5.0～6.0，放线菌：7.5～8.5 温度影响酶的活性，细胞膜的稳定性等，从而影响微生物对营养物质的吸收等。 氧：不同的微生物代谢类型不一样，对氧的需求不一样，环境中氧含量的状况，对不同代谢类型的微生物群体的生长，具有不同的影响。 好氧型：其代谢需要氧气参与，如：多种细菌和大多数真菌。 厌氧型：微生物在生活过程中不需要氧气，如：某些链球菌等。 严格厌氧型：微生物短时间接触空气，会造成生长停滞，甚至导致死亡，如：某些产甲烷杆菌 兼性厌氧型：在有氧和无氧条件下，能以不同的代谢方式生长繁殖，如：酵母菌
第三节 发酵工程简介 （一）发酵 发现：1857年，法国微生物学家巴斯德发现了发酵原理，发酵是微生物活动的结果。
（二）应用实例 谷氨酸发酵生产：谷氨酸是鲜味剂味精的主要成分，以前用植物（如大豆）蛋白质水解法生产。1957年，日本率先用微生物发酵法生产成功。 菌种：谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等 培养基：为培养液 碳源：常用豆饼（或马铃薯等）的水解液、玉米浆 氮源：尿素 无机盐：磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁 生长因子：生物素 前期处理：培养液配制完成，投放发酵罐，98kPa蒸汽灭菌，冷却，在无菌条件下接种 发酵设备：发酵罐——几升到几百万升不等，连接有通气、搅拌、接种、加料、冷却、pH检测等装置 发酵条件：不断地通入无菌空气，搅拌，温度为30～37摄氏度，pH为7～8的条件，经28～32 h培养 搅拌： a. 使空气形成细小的气泡，迅速溶解在培养液中（称溶氧） b. 使菌种与培养液充分接触，提高原料的利用率 产品提取：将谷氨酸分离提取出来，用适量的Na2CO3溶液中和，再经过过滤、浓缩、离心分离等制成味精。
（三）发酵工程 概念：指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术 内容：菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等 过程：
菌种的选育 种类、产量和质量等方面符合人们要求性状优 良的菌种。 方法：诱变育种 用紫外线、激光、化学诱变剂等处理菌种，筛选出符合要求的优良菌种。 细胞工程 构建工程细胞 基因工程 构建工程菌，生产一般微生物不能生产的产品 培养基的配制 在生产实践中，培养基的配方要经过反复的试验才能确定。 培养基来源 60年代前，常用薯类、谷类等粮食作物配制培养基 新型菌种和微生物酶的开发应用，野生植物淀粉、甘蔗渣、秸秆水解物，以及乙醇、醋酸等石化产品都能用来配制培养基 灭菌：发酵工程中所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（称杂菌） 要求：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌 影响：杂菌污染，导致产量大大下降或得不到产品 实例：青霉素生产如果污染了杂菌，这些杂菌会分泌青霉素酶，将形成的青霉素分解掉。 扩大培养和接种：大规模的发酵生产中，需优良菌种经过多次扩大培养，达到一定数量后，再接种 发酵过程：这是发酵的中心阶段 要求： a. 要随时取样检测培养液中的细菌数目、产物浓度等，以了解发酵进程 b. 及时添加必需的培养基组分，以满足菌种的营养需要 c. 要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件 不良影响： a. 影响菌种的生长繁殖 b. 影响菌种代谢产物的形成 例如：在谷氨酸发酵过程中，当pH呈酸性时，谷氨酸棒状杆菌就会生成乙酰谷氨酰胺 当溶氧不足时，生成的代谢产物就会是乳酸或琥珀酸。 条件控制：通过发酵罐上的各种装置进行 温度控制：通过发酵罐上的温度自动测试、控制装置进行检测和调整 溶氧的控制：通过通气量和搅拌速度加以调节 pH的控制：加料装置，添加酸或碱进行调节，也可以在培养基中添加pH缓冲液 注意问题：用工程菌等发酵生产时，对排出的气体和废培养液、设备等都有严格要求，防止这些人工合成的生物新种扩散，对环境及其他生物造成危害。 分离提纯：根据产物性质不同采取不同方式 代谢产物：采用蒸馏、萃取、离子交换等方法进行提取。分离提纯后的产品 菌体本身：如酵母菌和细菌等，采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来
（四）发酵工程的应用 发酵工程优点：生产条件温和，原料来源丰富且价格低廉，产物专一，废弃物对环境的污染小和容易处理等特点 在医药工业上的应用 生产药品：抗生素、维生素、动物激素、药用氨基酸、核苷酸（如肌苷）等 抗生素是人们使用最多的药物，也是制药工业利润最高的产品 基因工程药品：人生长激素、重组乙肝疫苗、某些种类的单克隆抗体、白细胞介素－2、抗血友病因子等生长激素释放抑制因子：是一种人脑激素，能够抑制生长激素的不适宜分泌，用于治疗肢端肥大症，用含生长激素释放抑制因子的基因的工程菌可发酵生产 在食品工业上的应用 第一，生产传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，使产品的产量和质量得到明显的提高。 第二，生产各种各样的食品添加剂，改善了食品的品质及色、香、味 第三，为解决粮食短缺问题开辟新的途径 单细胞蛋白：利用淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液、石化产品等为原料，通过发酵获得大量的微生物菌体 优点： a. 蛋白质含量高，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60％～80％，酵母菌的占45％～65％ b. 生长繁殖速度很快 c. 利用途径广：单细胞蛋白用做饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高，酵母菌等生产的单细胞蛋白可作为食品添加剂。高蛋白、低脂肪的特点 常用的几类食品添加剂
【模拟试题】 一. 选择题 1. 研究微生物的生长规律通常的处理是（ ） A. 将少量的细菌接种到恒定容积的培养液中，在适宜的条件下培养 B. 将少量的细菌接种到恒定浓度的培养液中，在适宜的条件下培养 C. 将大量的细菌接种到恒定容积的培养液中，在适宜的条件下培养 D. 将大量的细菌接种到恒定浓度的培养液中，在适宜的条件下培养 2. 在绘制微生物的生长曲线时要求的条件正确的是（ ） A. 培养基的成分不作改变，在恒定温度下长期培养 B. 培养基的成分不作改变，在自然发酵温度下长期培养 C. 培养基的成分随时调整，在恒定温度下长期培养 D. 培养基的成分随时调整，在自然发酵温度下长期培养 3. 对某微生物进行培养，测定微生物的生长情况的时候下列那组数据是有效的（ ） A. 接种15小时后，每毫升培养液中的细菌总数为五万个 B. 接种15小时后，每毫升培养液中活细菌总数为四万个 C. 接种15小时后，每毫升培养液的湿重为60克 D. 接种15小时后，每毫升培养液的干重为25克 4. 生长曲线的纵坐标表示的意义是（ ） A. 一定体积培养液中的细菌总数 B. 一定体积培养液中的活细菌总数 C. 一定体积培养液中的活细菌总数的对数 D. 一定体积培养液中的细菌总数的对数 5. 对于生长曲线的说法正确的是（ ） A. 各个时期有着明显的不同的分界线 B. 反映了细菌的种群在一定条件下的生长情况 C. 反映的是单细胞细菌个体的生长规律 D. 在衰亡期细菌不再进行繁殖 6. 调整期的细菌特征不正确的是（ ） A. 细菌代谢活跃，但细胞不立即进行增殖 B. 细胞内大量合成与细胞分裂有关的物质 C. 细胞的体积开始变大，初级代谢产物合成旺盛 D. 细胞的个体形态和生理特性都非常的稳定 7. 在对枯草芽孢杆菌的培养过程中，想获得大量的枯草芽孢杆菌的芽孢，最好的取样时期为（ ） A. 调整期 B. 对数期 C. 稳定期 D. 衰亡期 8. 在谷氨酸的发酵过程中，培养液的变化趋势为（ ） A. 培养液的PH值不断的下降，氧气含量不断下降 B. 培养液的PH值不断的下降，氧气含量不断上升 C. 培养液的PH值不断的上升，氧气含量不断下降 D. 培养液的PH值不断的上升，氧气含量不断上升 9. 在谷氨酸的发酵过程中，说法不正确的是（ ） A. 发酵罐内部可以看作是一个开放的生态系统 B. 若不加以搅拌，产物中能测出谷氨酸、乳酸、乙酰谷氨酰胺 C. 开始生产时先对培养罐灭菌，再对培养液灭菌，然后装罐 D. 发酵过程是一个产热代谢过程 10. 发酵过程说法不正确的是（ ） A. 大规模生产过程中，菌种必须先经过扩大培养，然后再接种以提高生产效率 B. 连续培养的过程中补充的培养液和空气必须先灭菌 C. 生产过程中排出的废弃物可直接作为农用肥料，实现物质循环利用，无废料生产 D. 分离代谢产物时，常用到蒸馏、萃取、离子交换等方法 11. 单细胞蛋白是指的（ ） A. 由工程菌发酵生产的动物蛋白药品 B. 由发酵获得的细菌合成分泌的氨基酸类代谢产物 C. 通过发酵所获得的大量微生物菌体 D. 微生物发酵产生的用途广泛的各种酶 12. 下列说法中正确的是（ ） A. 人工诱变、细胞工程、基因工程等都能对微生物进行定向改造 B. 环境条件的变化不仅会影响微生物的生长繁殖，也会影响微生物的代谢途径 C. 发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢产物的形成与搅拌速度无关 D. 单细胞蛋白是从微生物细胞中提取出来的 13. 下列微生物用于生产实践中必须不断通氧并且搅拌的是（ ） A. 用酵母菌生产酒精 B. 利用链球菌发酵生产抗生素 C. 产甲烷细菌进行沼气发酵 D. 用谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸 14. 下列对连续培养优点的叙述，不正确的是（ ） A. 能及时补充微生物所需的营养物质，提高产量 B. 有利于微生物尽快将代谢产物释放到培养基中 C. 能消除不利于微生物生长的某些环境因素 D. 提高了设备利用率 15. 对谷氨酸发酵的叙述正确的是（ ） A. 菌体是异养厌氧型微生物 B. 培养基属于液态的合成培养基 C. 谷氨酸的形成与搅拌速度无关 D. 产物可用离子交换法提取 16. 用于谷氨酸发酵的培养基需添加的生长因子是（ ） A. 氨基酸 B. 碱基 C. 核苷酸 D. 生物素 17. 关于菌种的选育不正确的是（ ） A. 自然选育的菌种不经过人工处理 B. 诱变育种原理的基础是基因突变 C. 通过有性杂交可形成工程细胞 D. 采用基因工程的方法可构建工程菌 18. 谷氨酸棒状杆菌扩大培养时，培养基应该是（ ） A. C:N为4:1 B. C:N为3:1 C. 隔绝空气 D. 加大氮源、碳源的比例 19. 灭菌的目的是（ ） A. 杀灭细菌 B. 杀灭杂菌 C. 杀灭所有微生物 D. 杀灭芽孢 20. 能影响发酵过程中温度变化的因素是（ ） A. 微生物分解有机物释放的能量 B. 机械搅拌 C. 发酵罐散热及水分蒸发 D. B、C都对 21. 在发酵中有关氧的利用正确的是（ ） A. 微生物可直接利用空气中的氧 B. 微生物只能利用发酵液中溶解氧 C. 温度升高，发酵液中溶解氧增多 D. 需向发酵液中连续补充空气并不断地搅拌 22. 当培养基pH发生变化时，应该（ ） A. 加酸 B. 加碱 C. 加缓冲液 D. 加培养基 23. 大量生产酵母菌时，不正确的措施是（ ） A. 隔绝空气 B. 在对数期获得菌种 C. 过滤沉淀进行分离 D. 使菌体生长长期处于稳定期 24. 基因工程培育的“工程菌”通过发酵工程生产的产品有（ ） ① 石油 ② 人生长激素 ③ 紫草素 ④ 聚乙二醇 ⑤ 胰岛素 ⑥ 重组乙肝疫苗 A. ①③⑥ B. ②⑤⑥ C. ③⑤⑥ D. ②③⑤ 25. 连续培养酵母菌的措施中不正确的是（ ） A. 及时补充营养物质 B. 以青霉素杀灭细菌 C. 以缓冲液控制pH在5.0～6.0之间 D. 以酒精浓度测定生长状况
二. 非选择题 1. 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，可从动物胰腺中提取，也可通过“工程菌”产生，后者与前者比较最显著的特点是_____________________。 2. 下面是家庭酿造甜米酒（醪糟）的具体操作过程。先将米加热煮至七成熟，待冷却至30℃，加少许的水和一定量的“酒药”（实际是酵母菌菌种）与米饭混合后置于一瓷坛内（其他容器也可），在米饭中央挖一个小洞，加盖后置于适当地方保温（28℃），12小时即可。请从以下几个方面对发酵过程做一简单的分析。 （1）先将米煮一煮的目的是______________。 （2）为什么要冷却到30℃后才能加入“酒药”？______________。 （3）在中央挖一个小洞的原因是______________。 （4）发酵坛并没有完全密封，坛内无氧发酵的环境是如何形成的？___________________________。 （5）家庭酿酒的关键是保温和放“酒药”，如果米的量很多而放的“酒药”太少，常常导致甜米酒因变质而失败。其主要原因是____________________________。 3. 生活污水中含有大量的有机和无机含氮化合物，这些过量的含氮化合物会造成水体污染，危害水生生物生存和人类的健康。脱氮是污水处理的重要内容之一。下面是生物脱氮工艺流程示意图。
（1）在1级反应池内，有机物在细菌、原生动物等作用下会大量减少。从同化和异化方式看，这些生物的代谢类型主要是___________，这些生物在自然生态系统中属于_________者。 （2）在2级反应池内，pH值为8.0～8.4时，硝化细菌大量繁殖，它们能将NH3氧化成NO2－和NO3－，并利用这一硝化过程所释放的________合成_____________，用于自身的生长发育和繁殖。 （3）实践发现，当2级反应池中有机物含量过多时，硝化细菌难以大量繁殖起来，原因_________________________________。 （4）在3级反应池内加入适量的有机物（如甲醇），并在低氧或无氧条件下，反硝化细菌繁殖起来，通过无氧呼吸把NO2－和NO3－还原成N2，无氧呼吸除释放能量外，还为还原反应提供了________________________。
【试题答案】 一. 选择题 1. A 2. A 3. B 4. C 5. B 6. D 7. D 8. A 9. C 10. C 11. C 12. B 13. D 14. B 15. D 16. D 17. C 18. A 19. B 20. D 21. B 22. C 23. A 24. B 25. D
二. 非选择题： 1. 生产条件温和，原料来源丰富且价格低廉，产物专一，废弃物对环境的污染小和容易处理等 2. （1）主要为了杀灭其他杂菌； （2）太高的温度会抑制或杀死酵母菌； （3）有利于透气，可保证酵母菌在开始生长时有足够的氧气，短时间内迅速繁殖； （4）有氧呼吸消耗了大量氧气，同时产生一部分水分，容器中发酵液增多了，淹没了米饭，形成无氧环境； （5）加的“酒药”少，造成酵母菌起始密度过低，不能迅速增殖形成生长优势，往往导致杂菌感染。 3.（1）异养需氧型；分解 （2）能量；有机物 （3）异养需氧型生物大量繁殖，抑制硝化细菌生长繁殖 （4）氢
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