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罗氏第二代创新高通量基因组测序系统
文/许冠东 罗氏诊断应用科学部
2007年9月28日，在《Science》国际顶级学术期刊的网站上，同时查询到3篇突破性的基础研究成果〔1－3〕。这三篇文章的研究对象和领域完全不同，分别涉及了对人类基因组变异的研究，蜜蜂社会性的进化讨论以及灭绝的古生物线粒体全序列的测定。然而共同的一点是，这三篇文章使用的分析数据和实验结果都来自罗氏454 公司研发的高通量测序技术平台Genome SequencerTM。在1周的时间里就有3篇GS系统在不同研究领域的文章发表在《Science》上，由此累计已有近100篇Genome SequencerTM的应用成果发表在《Nature》，《Science》，《PNAS》，《Cell》等世界知名期刊上，足以说明454测序技术和GS系统在生命科学研究领域的广泛适用性。
Genome Sequencer FLX（GS FLX）系统是罗氏旗下454 公司的第二代测序平台，GS FLX的命名正是来源于其多领域的灵活应用（flexibility）。GS FLX系统在技术原理和性能方面的表现优越，每个反应可以得到超过40万个序列读长，单个序列的读长可达250bp，一个测序反应就可以产出超过1亿个碱基数据。据了解，目前，Genome SequencerTM系统已经被世界上几乎所有从事基因组测序和相关结构功能研究的顶级实验室配备使用，相信随着Genome SequencerTM系统性能和应用领域的不断提升和扩展，必将带来整个测序领域的技术发展，对大规模基因序列研究的相关应用领域产生巨大的推动作用，例如基因组学、比较基因组学、转录组分析和基因调控等。
GS FLX系统超高通量测序技术原理
与GS 20一样，GS FLX系统的测序原理也是基于焦磷酸测序法，一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 (图 1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
GS FLX系统的操作过程
GS FLX系统减少了传统测序样品制备过程中对大型自动站的依赖，完全不需要进行繁琐的建库过程，也不必进行克隆挑取、微孔板处理等工作；利用磁珠和emPCR提供进行样品制备，同时提供完整的后续生物信息学分析解决方案。
1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA，及小分子RNA等等；不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。
2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300-800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。短的PCR产物则可以利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4)的工作。
3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术，将3’和5’端具有特异性的A和B衔接子连接到DNA片段上。衔接子也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。
4）一条DNA片段＝一个磁珠：衔接子使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，此磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。
5）一个磁珠＝一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。
6）数据读取和分析工具： GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析，及 120MB的从头测序工作等。
6）数据读取和分析工具： GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析，及 120MB的从头测序工作等。
GS FLX系统的技术优势
基于其特有的的技术原理和性能操作，GS FLX系统具备了以下诸多方面的卓越性能：
7.5个小时的一个测序反应，就可获得超过1亿的碱基数据
高通量测序产品中无可比拟的最长读长，可达300bp
通量更高，每个反应可以得到超过40万个序列读长
读长超过200bp时，单一读长的准确性可以超过99.5%
测序结果一致性超过99.99%
无需克隆和挑取克隆的操作工程，生成的完整基因组库，避免了克隆偏差的影响
测序成本的大大降低
具备完成的软件包是GS FLX系统的又一大特色，其简单易用的图形用户界面，可以直接用来进行作图，拼接和扩增产物差异检测等研究。
利用项目管理软件工具，可以把多次测序反应得到的数据进行成组分析，并且可以添加已完成的测序反应数据来进行其他方面的分析
同时可以整合Sanger测序结果进行拼接和作图，包括配对末端的拼接
支持将GS FLX的数据于第三方的软件工具整合，例如Cosed
可自主选择拼接时的参数
采用新一代的算法，保证获得高度可信的结果——无论是碱基识别，拼接作图，还是差异分析
GS FLX系统的广泛应用
这项技术的第一个“试验品”就是来自有“DNA之父”之称的James D Waston，他向454公司提供了自己的血液样本并获得了全部的基因组序列。目前GS系统的用户在《Nature》，《Science》，《PNAS》等世界顶级的期刊杂志上已经发表一百篇的学术论文。（详细列表请查询https://www./sis/sequencing/genome/index.jsp）。与GS 20系统相比较，硬件配置和软件系统方面的革新改进，使得GS FLX系统具有了更广泛的应用，包括：
基于末端配对（Paired-End）应用的从头测序（De Novo Sequencing）
BAC文库的重测序（Resequencing）
基于全基因组测序的比较基因组学研究
生物群总体基因组和微生物多样性
考古学
扩增产物的测序，识别高可信度的SNP位点
小分子RNA
转录组分析
甲基化和基因表达调控的研究
当前全球众多从事测序技术研发的工作者都在为实现只需$1,000就可获取个人基因组序列信息的目标而努力着，一旦这个目标得以实现，个性化的早期疾病诊断和医疗服务将不再只是梦想。罗氏454公司也将同样以此做为努力的方向，不断地提升现有FLX系统平台功能，包括读长的增加，改进提升数据输出和分析工具；对实验成本、覆盖率以及时间安排等方面的优化等。
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