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2010-10-18  bengua1985   |  转藏
   

菌落PCR资料

菌落PCR
菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于,直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单,快接,阳性率较高,在转化鉴定中较常见。
操作方法:
1,挑取单个菌落,可以用高压灭菌的牙签。现在含抗性的平板上画线,做保种用,然后置于20ultriton-x100中搅和一下,将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号
2,将装有20ulTritonx-100的EP管100度煮2分钟
3,按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系,建议做20ul体系,模板加煮过的菌的上清1ul
4,上机即可。退火温度可以稍低,虽然没有什么根据可言,但是个人经验,推荐比质粒PCR时稍低
5,电泳,看结果,阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇,保种或者送测序都可以

我的做法是:
用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中,然后悬浮菌液。
在做PCR时,吸取1uL做摸板,但电泳检测后,选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。这样做, 既初步检测了阳性克隆,又保存了所需要的菌落。
当然,在挑菌时也有用接种环挑的, 有用牙签挑的, 看个人的爱好了

我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下,一般都能鉴定出来。想节省麻烦的话,还可以菌落鉴定同时挑单克隆,用1.5的EP管装1mL左右培养基,牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。

把PCR体系先加好,用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以上机P了,我每次都是这样,可能是最方便的方法了。

取200ul水,牙签挑菌,煮沸5‘,冰浴5’,12000rpm,取上清5ul做模版。其他的和普通pcr一样。

我们都是用过夜培养的菌液0.3ul(不要超过0.5ul)做模板,很简单的,其它都不变。先94度5min 裂解菌,最好5min后再加入taq酶。

是的,菌落PCR不难。。但是如果发现结果出现非特异带,在目的带位置有很弱的条带出现,最好再用液体培养后再做一次PCR,我就因为这个阴性结果折腾了1个月。。扩培后再作菌落PCR就得到阳性结果了。。

我是这样做的,取菌液60ul至ep管中,沸水中煮5min,离心,取其中上清1ul作模板,屡试不爽

拿牙签点一下菌落然后再体系里面涮一下就可以了
如果觉得不可靠,就索性接个种,摇个小管,然后取1ul作模板
模板如果太多了,引物就不够用了,显然扩不出来,这种现象在质粒这种模板的PCR里面很多,你提出来的质粒不要忘记稀释

一般来说, 菌落PCR能够筛选阳性克隆. 象你的实验中出现的这种假阳性结果, 也不是什么太反常的事情, 细菌本身的基因组也是反应系统中的组分, 所以难免有些假阳性的结果. 建议多用几对不同的引物扩增, 以增加真阳性筛选结果.
一般会出现假阳性,可能是粘在菌落上的目的基因被污染,建议引物一个为目的基因一个为载体上的,用无菌牙签挑取菌落,在配好的PCR体系中赞一下,PCR反应条件为95度10分钟94度40秒退火55度40秒72度1分钟30个循环

建议酶切后鉴定时同时取一个未做酶切的质粒做对照,明确是否能切断,再考虑是否能切出目的片段。
假阳性并不高,可挑菌落摇菌12小时以上再取菌液pcr,初始变性温度可设为98度。

我们一般将接种好的菌液煮沸15min,4000rpm离心5min,用上清作模板,效果很好。

非常方便的方法,我做了不知多少次,从未失手.
1.挑取菌落加入50ul dd水中,振摇.
2.99度, 5'灭活菌液中的酶
3.12000rpm离心1'去除细胞碎片
4.取上清pcr,50ul体系取10ul

我做就是将菌株挑一点点加入PCR体系中,涮一涮.我没有煮沸和离心.剩下的菌落放到37度继续让它长大一些,方便接种.
刚做的时候强烈建议大家要做阴性对照和阳性对照,因为有时候会有假阳性,即使阴性对照也会在目的位置出现条带,只是亮度弱一些而已.
我的经验是:若是真阳性,会很亮,让你不会怀疑;如果似有似无,一般都是假阳性.

菌落PCR ,菌液PCR(菌液的体积不能过大,大了会影响PCR体系,导致扩增不出来,一般取0.3微升左右就行了)都可以的,一般10微升的PCR体系,跑样时用小梳孔,(凝胶使用第一次时做回收用,将溴酚兰及核酸以外的凝胶割下来,就可以再用来做鉴定胶了,一般鉴定用的旧胶用2次都是可以的,比较节省)。

理论上,基因特异性引物和载体上的通用引物都是可以的。最重要的是带marker,先判断大小。当然最后还要提质粒酶切鉴定一下。一般PCR阳性的菌,正确的可能性非常大。但也不排除PCR阳性,但酶切阴性的可能,因为如果基因是PCR后克隆到载体的,可能会存在碱基突变的可能。
所以需要PCR和酶切两种方法鉴定。但最终应以测序的结果为准。

跑得很好的电泳:200v,我的目的片断是400多pb,2%普通胶,跑了大概20分钟左右吧

菌落PCR很容易出现假阳性,可能与菌落本身的含量过于复杂所导致的
1。用载体引物来作一般可以降低假阳性。
2。菌落PCR作出来如果都是阳性或是阴性都不对,如果出现有的有,有的没有,那么可以将其摇成菌液,作菌液PCR,或是直接再次涂版,然后提取菌落作PCR,如果个个都是,证明准确。
3。菌落PCR的假阳性很引物本身有很大的关系,所以建议鉴定做好还是酶切最为可靠,我吃过很多关于菌落PCR的亏,所以建议还是酶切

试一下热启动,可以消除引物二聚体。


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