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麦胚黄酮类提取物对人乳腺癌细胞Bcap-37的体外抑制作用
卫生研究 1999年第3期第28卷 达能营养中心青年科学工作者论坛 作者：徐贵发 赵秀兰 赵 丽 胡 萍 孙淑爱 单位：徐贵发 赵秀兰 赵 丽 胡 萍 孙淑爱 山东医科大学营养与食品卫生教研室，济南 250012 关键词：麦胚；黄酮类化合物；细胞培养；生长抑制 摘要：应用MTT法、克隆形成实验、3H-TdR掺入实验测定了麦胚黄酮类提取物对人乳腺髓样癌细胞株BCap-37的生长抑制作用，结果显示麦胚黄酮类提取物能明显抑制人乳腺髓样癌细胞株BCap-37的生长、克隆形成和DNA合成能力，均呈现明显的剂量-效应关系，并随作用时间延长其效果增强；因此麦胚黄酮类提取物可能是通过抑制了BCap-37细胞DNA的合成而降低其生长和繁殖的能力。 中图分类号：R737.9 R730.51 O625.31 Inhibition of human breast cancer cell line BCap-37 by flavonoid extract of wheat germ in vitro Xu Guifa, Zhao Xiulan, Zhao Li,Xu HuPing,et al. Department of Nutrition and food hygiene,Shandong Medical University,Jinan 250012,China Cell growth and proliferation were measured by microculture tetrazolium(MTT) assay,cell colony-forming assay and the synthesis of DNA by ３H- thymidine incorporation. Flavonoid extract of wheat germ resulted to a dose-dependent,time-dependent growth inhibition,reduction of colony and ３H-thymiding incorporation in DNA of human breast cancer cell BCap-37.These findings indicated that the flavonoid extract of wheat germ can inhibit tumor cell growth and proliferation by blocking DNA synthesis in vitro. Key words:Wheat germ, Flavonoids, Cell culture, Growth-inhibition blocking 黄酮类化合物是一类多环酚类化合物，主要存在于植物性食物和植物性饮料中，如全谷类、豆制品、水果、蔬菜等，包括黄酮、异黄酮、黄烷酮、双黄酮及其甙类等化合物，具有多方面的生物活性。本文观察了麦胚黄酮类提取物对人乳腺癌细胞的体外抑制作用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株 人乳腺髓样癌细胞株BCap-37购自北京市人民医院肿瘤研究室。 1.1.2 试剂及仪器 ①主要试剂：RPMI-1640、胰蛋白酶、HEPES、2，5-二苯基恶唑(PPO)、1，4-双-［2′-(5′-苯基恶唑)］-苯(POPOP)，均为Sigma公司试剂；四噻唑蓝(MTT)，Fluka试剂;［3H］-TdR，中国科学院原子核研究所生产：其它所用试剂均为国产分析纯及优级纯试剂。②主要仪器：美国SHEL-LAB CO\-2培养箱，Bio-TEK EL-309自动酶标仪，西安电子设备厂产FJ-2101双道液体闪烁计数器。 1.2 方法 1.2.1 麦胚黄酮类提取物的制备［1］ 鲜麦胚粉碎，经石油醚脱脂后，用含0.5%盐酸的乙醇回流提取，回收乙醇，得浸膏状物；加入5%盐酸，搅拌后放置，得酸性液；再将酸性液分别经氯仿、乙酸乙酯萃取后，以浓氨水调至碱性，氯仿萃取，再用水萃取氯仿液，水蒸干后得棕黄色黄酮提取物，纯度为80%。 1.2.2 实验分组 实验组1～5组细胞培养液中麦胚黄酮类提取物的终浓度分别为1、2、3、4、5g/L；空白组(0组)，细胞培养液中加入与实验组等浓度的溶剂。 1.2.3 细胞生长抑制实验(MTT比色法) 将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后，制成2×10５/ml的细胞悬液，然后以每孔198μl接种到96孔板上，在37℃、5%CO\-2饱和湿度条件下培养24h，将麦胚黄酮类提取物用50%乙醇配成100、200、300、400、500g/L的溶液，各实验组分别加入上液2μl，即各实验组中黄酮类提取物的终浓度分别为1、2、3、4、5 g/L，空白组加入等体积的溶剂，实验组及空白组均平行6孔。分别于作用24、48、72、96h时加入5g/L的MTT 10μl，培养4h，弃培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，置室温15min后，经酶标仪在检测波长570nm，参比波长630nm下测定各组的吸光度(A)。 1.2.4 克隆(集落)形成试验 取50℃左右5%的琼脂1份，迅速加入9份预温37℃的新鲜培养液，混合均匀，取0.8ml置于2ml的平皿中，室温使琼脂凝固备用(此即为底层琼脂)。将对数生长期的细胞制成1×10３/ml的细胞悬液，并将黄酮类提取物按上述终浓度加入到细胞液中，空白组加入等体积的溶剂，各取0.9ml置于已铺有底层琼脂的平皿中，每皿中立即加入温度在50℃左右的3%琼脂0.1ml，充分混匀，在37℃、5% CO\-2饱和湿度条件下培养15天，于显微镜下计数细胞集落数(≥50个细胞)。各组平行样品3个。 1.2.5 ［３H］-TdR掺入实验 ①将对数生长期的细胞制成1×10５/ml的细胞悬液，接种于24孔板上，每孔1ml，24h细胞贴壁后，换含有上述浓度黄酮类提取物的新鲜培养液，于48h时弃去培养液，于每孔中加入含有［3H］-TdR(37kBq/ml)新鲜培养液1ml，继续培养4h，小心弃去培养液，用生理盐水漂洗2次，然后用10%的三氯醋酸沉淀，加0.3mol/L的SDS-NaOH 0.5ml，在60℃水浴30min，冷却至室温，完全收集上述裂解液，无损的移入闪烁瓶中，加闪烁液5ml(PPO-POPOP-二氧六环系统)室温暗环境中过夜，用β液闪仪测定各瓶的放射性活度(cpm)。每组平行样品3个。②另取1×10５/ml对数生长期细胞液1ml加入到24孔培养板中，24h细胞贴壁后，每孔按终浓度2.5g/L加入黄酮类提取物，按上述步骤分别测定黄酮类提取物作用24、48、72、96h时的cpm值，每个时间平行样品3个。 1.2.6 数据处理 数据分别经SAS、PEMS统计软件包进行方差分析和秩和检验。 2 结果 2.1 麦胚黄酮类提取物对乳腺髓样癌细胞株BCap-37生长的抑制作用 在培养细胞中加入1～5 g/L的麦胚黄酮类提取物后，对细胞生长具有明显的抑制作用(P＜0.01)，且呈现剂量-效应关系(见表)。并随时间延长其抑制作用增强。同时本实验还观察了溶剂乙醇对BCap-37细胞的影响，结果显示，在1%浓度以下，上述作用时间下乙醇对细胞生长无任何影响(P＞0.05)。 附表 不同浓度麦胚黄酮类提取物在不同作用时间对BCap-37细胞生长的影响(±s,n=6) （1）A 剂量组 (g/L)24h48h72h96h 00.3607±0.02770.5933±0.09460.9503±0.06211.2050±0.1723 10.3375±0.0424(1)0.3710±0.07350.3418±0.05200.2528±0.017 20.2537±0.02170.3085±0.04460.3181±0.01130.2738±0.0245 30.2537±0.03500.2815±0.02170.2802±0.02000.1915±0.0144 40.2143±0.01410.1368±0.01900.1913±0.02810.1532±0.0085 50.1615±0.02780.0988±0.02380.0467±0.01630.0427±0.0070 注：(1)除此组外，各组均与空白组比较 P＜0.012.2 麦胚黄酮类提取物对细胞集落形成的影响
在无黄酮类提取物存在时，BCap-37细胞分裂增殖速度快，每皿中细胞集落数多，且组成每一集落的细胞数目亦多，可达几百个。含低剂量的黄酮类化合物的平皿中，BCap-37细胞形成的集落少，组成集落的细胞数目也明显低于空白组。当黄酮类提取物的终浓度达5g/L时，几乎不再有集落形成。故呈明显的剂量-效应关系(P=0.0058)。 2.3 麦胚黄酮类提取物对细胞DNA合成的影响 经黄酮类提取物作用后，BCap-37细胞中３H-TdR的掺入量明显低于对照组，随作用时间延长其cpm值也越低。说明麦胚黄酮类提取物能明显阻断BCap-37乳腺癌细胞DNA的合成，随剂量和时间的增加其阻断作用增强。 3 讨论 黄酮类物质因其结构与雌激素类似，具有微弱的雌激素样作用，故称之为植物雌激素。这种弱的雌激素作用，在一定情况下会表现出抗雌激素活性，这种作用取决于动物体内雌激素水平，对于雌激素水平较低的个体表现出雌激素样作用；而对于雌激素水平较高的个体则呈现抗雌激素作用［2］。已有研究证明植物雌激素是酪氨酸蛋白激酶(TPK)的抑制剂，对多种激素依赖性肿瘤细胞有抑制作用和细胞毒性作用［3］。由本实验结果亦可见麦胚中的黄酮类提取物对乳腺癌细胞株BCap-37具有较强的生长抑制作用。由于肿瘤细胞的生长具有不受控制性，也无接触抑制，所以，形成集落的能力比正常细胞强，故集落形成实验是测定肿瘤细胞增殖能力的有效方法之一。本实验结果显示麦胚中的黄酮类提取物对BCap-37细胞具有较强的抗增殖作用。 胸腺嘧啶核苷酸(TdR)是DNA分子的组成成分，3H掺入量的多少反映了DNA的合成速度，在本实验中，当麦胚黄酮类化合物的终浓度在4g/L时，DNA的合成几乎被完全阻断；同时，实验结果也表明其阻断DNA合成的效果与作用时间呈正相关。故麦胚黄酮类提取物通过抑制DNA的合成而抑制了BCap-37细胞的生长和增殖。 此外，黄酮类化合物还可以在实体瘤中通过抑制血管的形成，不可逆地抑制肿瘤组织的血液供应，达到阻止肿瘤生长的目的［4］。黄酮类化合物也能增强肝脏合成性激素结合球蛋白(SHBG)，从理论上这种增强可以通过减少血液中游离的有活性的性激素而降低与性激素有关的癌的危险性［8］。因此，黄酮类化合物能通过多种途径抑制肿瘤的发生、发展，而麦胚又是黄酮类化合物的良好来源，有开发利用前途。 本文来自:大众医药网
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