植物体内游离脯氨酸含量的测定
植物在正常条件下,游离脯氨酸含量很低,但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时,游离脯氨酸便会大量积累,并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此,脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。 【原理】 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸,不仅大大减小了其他氨基酸的干扰,快速简便,而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下,脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物,用甲苯萃取后,此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 【仪器与用具】 分光光度计;水浴锅;漏斗;20ml大试管数支;20ml具塞刻度试管9支;5~10ml注射器或滴管。 【试剂】 3%磺基水杨酸水溶液;甲苯; 2.5%酸性茚三酮显色液:冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合,作为溶剂进行配制,此液在4℃下2~3日有效; 脯氨酸标准溶液:称取25mg脯氨酸,蒸馏水溶解后定容至250ml,其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml,即成10μg/ml的脯氨酸标准液。 【方法】 1.标准曲线制作 表38-1 各试管中试剂加入量
(1)取7支具塞刻度试管按表38-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞,在沸水中加热40min。 (2)取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡,以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。 (3)以消光值为纵坐标,脯氨酸含量为横坐标,绘制标准曲线,求线性回归方程。 2.样品测定 (1)脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2~0.5g(干样根据水分含量酌减),分别置于大试管中,加入5ml 3%磺基水杨酸溶液,管口加盖玻璃球,于沸水浴中浸提10min。 (2)取出试管待冷却至室温后,吸取上清液2ml,加2ml冰乙酸和3ml显色液,于沸水浴中加热40min,下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。 (3)结果计算:从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度,按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。 脯氨酸(μg/g FW或DW)= 式中 C—提取液中脯氨酸浓度(μg),由标准曲线求得; V—提取液总体积(ml); a—测定时所吸取的体积(ml); W—样品重(g)。 【思考题】 1.植物体内游离脯氨酸测定有何意义? 2.当改变萃取剂时,比色应做哪些改变?如何选择最适波长?如何选择最佳萃取剂? |
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