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细胞调亡与坏死鉴别的简便方法 midas
1、PI和Hoechst33342双标：
PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。我最近在作的试验就是用的这种方法，附上一张我染的PC12细胞的图片，请大家指教。更精确的定量可以通过流式细胞仪来检测。用PI和Hoechst33342双标鉴别调亡、坏死，这种方法简便易行，结果比较可靠。
2、PI和Calcein-Am双标：
Calcein-AM 是一种绿色荧光标记物，可显示胞浆，为膜通透性的荧光染料。Calcein-AM 一旦进入胞内，便可被内源性酯酶水解成绿色荧光物质calcein, 并保留在胞浆中。细胞处于调亡时，由于核成碎片状，从而使此时的胞浆的calcein着色呈碎片状，但是PI为阴性。细胞坏死时，胞浆的calcein染色基本上属于正常，但是PI为阳性，有时可以看到膜内有空泡。但是晚期调亡细胞，胞浆有calcein着色并呈碎片状，而且PI为阳性。
3、PI和Annexin-V双标：
Annexin-V（green）可以和胞膜内的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。正常细胞膜的磷脂双分子层排列整齐，但是如果细胞损伤时，酯脂双分子层的排列就会被打乱，内层的可能会翻转到外层，Annexin-V就可以检测到这种现象。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性。
可用confocal来进行双标观察计数或流式细胞仪定量检测。
4、Leukostat染色：
活细胞Leukostat染色，核呈棕色，胞浆透明；调亡细胞核浓集，呈黑、褐色，变小，胞浆不可见；坏死细胞溶解呈空壳。 这种方法现在少用。
补充：鉴别细胞调亡与坏死的方法挺多，但大多比较繁琐，我总结的这几种方法则是简便易行，最适合于经费比较紧张的研究生们。
针对朋友的提问，回答如下：
1、试剂来源： PI和Hoechst33342都是sigma公司的粉剂，不是kit，
2、具体方法： 将PI和Hoechst33342的终浓度调到10μg/mg就行，用PBS，Hank's液、生理盐水或D液任何一种溶解都可以。Hoechst33342染色37℃10min就达到饱和，PI在4℃10~20min就行。
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