【生理学课外读物】电生理学发展简史（二）

白云岫水 2010-12-31

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但是， Hodgkin 和 Huxley 利用细胞内电极在记录枪乌鲗巨轴突静息电位的基础上观测受刺激后产生的动作电位时，却使人意外地发现，动作电位的幅度大大超过了零电位（ + 30 ~+ 50mV ），出现膜电位的倒转（超射），这是用膜对各种离子通透性普遍增大的理论无法解释的。考虑到经公式计算的钠平衡电位在 +50mV 至 +70mV ， Hodgkin 和 Huxley 提出了一个新的 “ 离子学说 ” ，即动作电位期间膜对钠通透性瞬间增大并远远超过了对钾的通透性。

3. Hodgkin 的离子学说 1949 年 Hodgkin 和 Huxley 用氯化胆碱或葡萄糖等张地替代神经纤维周围海水中的 NaCl ，结果表明，这种状况下的动作电位幅度、升支上升速度和动作电位传导速度都下降了，其下降程度随钠离子被替代比例的增大而增大（图 3 ），从而证实了他们的离子学说，即安静时选择性地对钾通透，而兴奋时对钠的通透性瞬间增大。 1951 年， Keynes 和 Lewis 利用同位素 24 Na + 的定量研究也证明，在给予枪乌鲗神经巨大轴突几分钟连续刺激后，浸浴液中的 24 Na + 大量进入轴浆，经计算，每次动作电位进入细胞内的 Na + 约为 21000/ m m 2 。如果细胞膜的膜电容为 1 m F/cm 2 ，这一 Na + 流量足以使膜去极化达 100mV 以上。不过这种实验还不能分析动作电位期间的 Na + 内流和膜对 Na + 通透性变化的精确的时间过程。

图3 降低细胞外 Na + 浓度对枪乌鲗巨轴突动作电位的影响

图中 1 和 3 分别为实验前和实验后海水灌流的反应，

2 为实验灌流液，由海水和等张的葡萄糖溶液混合配制，

其中海水所占比例为a, 33%； b, 50%；c, 71%

1949 年 Ling 和 Gerard 创立了微电极技术，使人们有可能对多种细胞作细胞内电位的直接测量。各类可兴奋细胞上所测得的静息电位与动作电位大致与上述情况相似。

4. 探讨动作电位期间膜对离子通透性的变化 ―― 电压钳技术的建立及其贡献细胞膜对动作电位期间离子通透性（膜电导）变化的直接测定是从应用电压钳（ voltage clamp ）技术以后开始的。该技术是 1949 年由 Cole KS 及 Marmont G 设计的，后经 Hodgkin 和 Huxley 和 Katz 等加以改进，并成功地应用于枪乌鲗巨轴突动作电位期间离子电流的研究。电压钳技术的基本原理就是欧姆定律，即：

I m = g·V m

式中 g 为膜电导， V m 为膜电位， I m 为膜电流。该式表明，为了测定动作电位期间膜电导 g 的变化，只要膜电位 V m 保持不变，膜电流 I m 就可以作为观测膜电导 g 变化的指标。但事实上，动作电位期间 V m 发生了快速变化，使膜电导 g 与膜电位 V m 互为因变量，又夹杂产生了大量的电容电流，从而使 I m 的测量失去意义。电压钳技术就是为了克服这一困难而设计的。它通过一个反馈电路向膜内注入电流迫使 V m 保持恒定，此时 I m 的变化就可反映 g 的变化。

图 4 就是这一技术的示意图。 Hodgkin 和 Huxley 利用电压钳技术，直接测定了动作电位期间的膜电流，推算出钠电导和钾电导的变化，并用一组数学模型方程式，定量地描述了这个变化过程，很好地模拟了包括动作电位形状在内的可兴奋膜的各种兴奋与传导的特性。他们提出的描述电压门控通道门控动力学的基本概念至今仍被沿用。他们也因此荣获 1963 年度诺贝尔生理学或医学奖。

图4 电压钳技术示意图

A ：纵向电极法； B ：双微电极法

FBA ：反馈放大器； E ：监测膜电位， C ：指令膜电位； I' ：注射电流； I ：记录电流。 FBA 的两个输入端除接受膜电位 E 的输入外，另一个接受指令电位 C ，当两者电位相等时输出电流为零，当两者出现差异时， FBA 经电极 I' 输出电流，电流穿越细胞膜流出产生电压变化，使 E 趋向于 C ，如此便构成一个使膜电位始终保持于 C 的负反馈回路

三、离子通道概念的提出

1955 年， Hodgkin 和 Keynes 首次提出细胞膜上含有离子通道（ ion channel ），它们分别对某种离子有选择性的通透能力，并且通过自己的 “ 开放 ” 或 “ 关闭 ” 等状态的改变而影响和决定膜对某种离子的通透性。此后，陆续发现一些毒物或药物能够选择性地阻断膜对某些离子的通透，如河豚毒可以选择性地阻断膜对 Na + 的通透而不影响对 K + 的通透，四乙铵则可影响膜对 K + 的通透而不影响对 Na + 的通透。这些毒物或药物的作用很可能就是特异地结合了膜上与某种离子通透有关的通道结构。有人用同位素标记的河豚毒做实验，发现它们只和细胞膜上散在的一些蛋白质分子作 1 ∶ 1 的结合，并可由此算出 Na + 通道的密度。 Na + 通道在枪乌鲗巨大轴突膜上的密度约为每平方微米 550 个，在兔迷走神经纤维膜上约为 100 个，在一些有髓鞘神经纤维朗飞结处的膜上可达 10 4 ~ 10 5 个。如果把计算所得的 Na + 通道数目和膜兴奋时的 Na + 内流量作比较，则可得到兴奋时每秒钟将有多于 10 7 个 Na + 流过 Na + 通道。这个速率超过钠泵主动转运 Na + 速度的 10 5 倍，比体内一般酶反应的转换速率快 100 倍。再加上此速率的温度系数较低， Q 10 （即温度每增加 10 度速率增加的倍数）与 Na + 在水中自由扩散系数的 Q 10 相近似，因此可以设想，当膜对 Na + 的通透性增加时，膜上的钠通道蛋白结构中打开了某种水相孔洞。因此，如何能观测到这种推测中的单个离子通道的活动，以证实膜上离子通道的存在，成为当时许多研究者追求的目标。后来膜片钳技术的建立圆满地解决了上述问题，但是在此之前有两个技术曾为人们认识单通道活动的特征和启发膜片钳技术的思路做出了贡献，它们是波动分析（ fluctuation analysis ）技术和人工脂膜（ artificial lipid bilayers ）技术。

四、单通道电流的记录 ―― 膜片钳技术的建立和发展

1969 年 Bean 等将电压钳技术应用于塑料隔板小孔上形成的小片人工脂膜，他们发现在几乎绝缘的人工脂质双层中掺入少量的细菌蛋白后，脂膜成为可导电的，并记录到断续的阶梯状的跨膜电流。 1970 年 Hadky 和 Haydon 在同样的人工脂膜中掺入少量的短杆菌肽（ gramicidin ） , 也记录到形式相同的跨膜电流（图 5 ）。这些证据表明，阶梯样电流是由于搀入了能形成孔洞样结构的蛋白质所致，每一阶梯反映了单个通道蛋白分子的开放和关闭。因此，单通道的电活动是首先在人工脂膜上记录到的。