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细胞膜水通道的发现（一）
2003 年 10 月 8 日 ，瑞典皇家科学院将 2003 年诺贝尔化学奖授予时为 The Johns Hopkins University School of Medicine 生物化学系（现为 Duke University 医学中心副主任）的 Peter Agre 教授，以表彰他发现细胞膜水通道并证明其功能这一开创性贡献。 Agre 教授 1949 年出生于美国，他的祖父辈们在 19 世纪末从瑞典和挪威移民到了美国。其父 Courtland Agre 毕业于 University ofMinnesota ，并 获得了化学学士和博士学位。二战期间曾是 3M company 即明尼苏达矿务及制造业公司的化学专家，负责实验室合成多聚物。二战后先后成为 St. Olaf ColIege 和 Augsberg College 化学系的一位教师。 Peter Agre 教授能从事基础研究，与从小受其父影响不无关系。 身为细胞生物学的教授， Peter 教授并非科班出身于分子生物学。 1967 年至 1970 年，他就读于 Minneapois ， Augsburg college 的化学专业，并获得学士学位。 1970 年至 1974 年，进入 Johns Hopkins Uuniversity school of Medicine 获医学博士学位，并在 1981 年获得医师执照。 1974 年至 1975 年， Peter A gre 在 Johns Hopkins 药理学系 Pedro Cuatrecasas 的实验室进行博士后的研究。 1984 年， Peter 在 The Johns Hopklns University 的 the old Blalock Building 建立 了 第一个自己的实验室。当时作为血液学家， Peter 和助手 Andy Asimos 开始研究球形红细胞增多症 （ spherocytosis ） ，并分别与 1985 年和 1986 年在 Nature 和 New England Journal of Medicine 上发表了相关文章，证明血影蛋白（ spectrin ） 缺乏与临床上球形细胞增多症 （ spherocytosis ） 的严重程度有关。
一、细胞膜水转运的研究简史 20 世纪 20 年代，随着对细胞膜的脂质双分子结构的认识，人们普遍认为水是以简单扩散的形式通过细胞的脂质双分子层 —— 即水分子的简单扩散学说。研究水的通透性有两个指标，扩散水通透性（ diffusional water permeability, Pd ）和渗透水通透性（ osmotic water permeability, Pf) 。所有组织细胞膜都允许水的简单扩散。不同组织的 Pd 值不同，但变异不大。 Pd 值较低，约为 10 m m/s ，并呈现出温度依赖性；水分子的简单扩散需要较高的阿仑尼乌斯活化能（ Arrhenius activation energy, 以下简称 Ea ）， Ea > 10 kca/mol 。膜脂质的分子组成和流动性影响水的扩散，故水分子的简单扩散不能被汞等通道蛋白阻断剂所抑制。渗透水通透性 Pf 反映的是水在跨膜梯度存在下的渗透情况。如果 Pf/Pd 值近似为 1 则表明水的跨膜运动是通过简单扩散完成的。 然而水分子简单扩散理论不能解释一些生理现象，如尿的浓缩、 Pf/Pd > 1 时水的转运以及有些细胞水转运可被通道蛋白阻断剂抑制等，所以就产生了另一种理论，认为细胞膜上存在水分子转运的特殊通道，即水通道学说。水通过水通道时需要的 Ea 较低，一般 Ea < 5kcal/mol 。这种通道具有高度的选择性，水穿过这样的细胞膜几乎没有阻力，而酸性的水合氢离子（ H 3 O + ）却不能渗过这种细胞膜。 在上世纪六七十年代，水转运领域的先驱们首先提出水通道蛋白的存在，这些前辈们包括：波士顿的亚瑟 · 克 · 所罗门（ Arthur K. Solomon ）、纽约的艾伦 · 菲克尔斯代恩（ Alan Finkelstein ）、伯克利的罗伯特 · 梅兹（ Robert Macey ）、罗马尼亚的乔治 · 本格（ Gheorghe Benga ）、委内瑞拉的盖勒姆 · 怀特姆拜瑞（ Guillermo Whittembury ）和阿根廷的马里奥 · 潘瑞斯（ Mario Parisi ）。他们通过生物物理的方法证实了水通道存在于对水具有高渗透性的一些细胞中，如肾小管、唾液腺、红细胞。 Macey 等进一步证实了水穿越红细胞膜可被有机汞制剂所抑制，撤除药物后红细胞对水的通透性可以恢复，提示膜上存在一种对汞制剂敏感的水通道蛋白。 Pf/Pd 远远大于 1 也支持有水通道存在。 但要鉴定水通道的分子结构仍是一个非常困难的问题。在 Peter 之前，一些科学家曾试图克隆水通道，但未能成功。汞同位素标记出了几种膜蛋白， Solomon 标记了阴离子交换蛋白（波长 3 ）， Benga 标记了一组中的几个蛋白（波长 4.5 ）。然而，他们都没有分离出转运水的蛋白。
二、第一个水通道蛋白 ——AQP1 的发现 1988 年 Peter Agre 还是一名血液病学家，当时他正在研究 Rh 血型抗原，准备提高家兔体内的抗体数量以改变部分纯化的 Rh 多肽的性质。在分离 Rh 多肽（ 32kD ）时，同时得到了一个分子量稍小的 28kD 蛋白。因为这两种蛋白的一些物化和生化性质相似，因而开始时认为 28KD 是 Rh 多肽的裂解物。而后 Peter Agre 实验室的博士后 Brad Denker 和助手 Barbara Smith 采用去垢剂的方法纯化这种蛋白质。聚乙烯十二烷基磺酸钠凝胶电泳（ SDS-PAGE ）银染法在去垢剂分离析出物中发现了一条 28kD 的不连续的条带。此蛋白与 Triton X-100 不溶解的膜骨架蛋白连接。定量免疫印迹（ Quantitative immunoblots ）表明每个红细胞有 120000~160000 个 28kD 的拷贝。纯化的大鼠肾组织 28kD 与大鼠红细胞 28kD 非常相似。人肾组织 28kD 抗体免疫组织化学染色表明，近曲小管的顶端刷状缘有 28kD 的明显表达，因不能被常规的蛋白质染色剂如考马斯亮蓝着色，所以此蛋白没有被发现过，功能也是未知的。 然而在后续的研究中， immunoblot 和 two-dimensional iodopeptide maps 均表明 Rh 多肽和 28kD 蛋白是完全不同的，在结构上亦没有同源性。用羧肽酶选择性消化完整的红细胞和内膜外翻的囊泡表明胞内存在 5kD 的羧基末端区域。 28kD 红细胞跨膜蛋白有两种形式， 28kD 和 gly28kD 。多项研究证实 28kD 和 gly28kD 蛋白共同组成一个四亚基低聚物。纯化的 28kD 氨基端前 35 个氨基酸残基序列与 26kD 的晶状体主要内部蛋白有 37% 的相似。 Peter Agre 实验室的博士后 Preston 等从一个人骨髓的 cDNA 文库中克隆和分离了 28kD 蛋白的 cDNA 。它的编码区对应的是一个 269 个氨基酸的多肽，通过水解法分析预示着它有六个双分子跨膜区域，两个可能的膜外 N - 糖基化位点，氨基端和羧基端均在细胞内。这个分子的氨基端和羧基端在起源上有 20% 是相同的。 B 环和 E 环有更高的相关性，每一个环都包含了保守的模序——天冬氨酸、脯氨酸和丙氨酸（ NPA ）序列。 28kD 与已知的所有 NIP 蛋白家族有同源性。 major intrinsic protein of lens （ MIP26 ），为电压门控性四聚体，晶状体的纤维细胞通过 MIP26 吸收组织。 NIP 膜蛋白在多个物种中有分布。 28kD 蛋白最初被称为 CHIP28 ，即分子量为 28kD 的通道构成整合膜蛋白。检索遗传学的数据库，发现奶牛眼睛的晶状体、果蝇的脑组织、细菌和植物中都存在类似 CHIP28 DNA 的序列。这些线索进一步提示，这个 28kD 蛋白可能在水转运中起重要作用。 非洲爪蟾卵母细胞表达系统是目前公认的研究转移受体、通道、转运子、部分酶等基因功能的细胞系统。由于它天然不表达水孔蛋白，对水的通透性极低，对于研究水孔蛋白转运水的功能是一个理想的细胞模型。加州大学医学部的 Verkman 教授实验室在 1990 年做过研究，向非洲爪蟾卵母细胞中微量注入水或肾皮层和肾乳头 mRNA （此两者为大鼠来源），以及网织红细胞、脑、肌肉 mRNA （此三者为家兔来源），检测渗透梯度变化时卵母细胞渗透水通透性 Pf 值。结果显示，来自红细胞，肾近曲小管（皮层）和肾集合管（乳头）的水通道能够在爪蟾卵母细胞功能性表达，说明水通道是一种蛋白，而将肾 mRNA 注人爪蟾卵母细胞也可用于研究水通道克隆表达。 1991 年 Verkman 教授实验室又利用 stopped-flow light scattering 技术做实验。他们检测家兔红细胞渗透水通透性 Pf 值， HgCl 2 等物质对 Pf 值的影响以及反应自由能 Ea ，证明在所有已研究的哺乳动物红细胞中，家兔红细胞的 Pf 值最大，而在已研究物质中 HgCl 2 对 Pf 的抑制作用最强。观察非洲爪蟾卵母细胞注入 50nl 水或者注人家兔网织红细胞未分裂的 mRNA （ 1mg/m1 ）前后渗透水通透性 Pf 值， HgCl 2 等物质对 Pf 值的影响以及反应自由能 Ea 的变化。结果表明，红细胞和注人家兔网织红细胞未分裂 mRNA 的爪蟾卵母细胞中水通道的特性相似，红细胞中的水通道是可以被克隆表达的。 1992 年， Peter Agre 及其在霍普金斯大学的同事 Bill Guggino 协作，测试了 28kD 蛋白可能的水转运功能。他们采用非洲爪螗卵母细胞，对照卵母细胞注射水，实验卵母细胞注射 2ng 的 CHIP28 的 cRNA 。三天后，对照组和实验组卵母细胞体积完全一样。将其转移到蒸馏水中，因为对照组的卵细胞对水的通透性非常低，细胞没有膨胀。形成鲜明对比的是，实验组的卵母细胞对水具有高度的渗透性，像爆米花一样膨胀。这个蛋白因此被命名为水通道蛋白，后来被正式命名为 AQP1 ，它是第一个被定义为水通道的蛋白。 Peter Agre 在霍普金斯大学的同事 Ambudkar 等（ 1992 ），使用人工合成的直径小于 0.1 m m 的脂质囊，向其注人再生纯化的 CHIP28 。研究进一步证实 CHIP28 专一性转运水的特性而不是诱导或调控爪蟾卵母细胞中水通道的表达。 Maunshach 等（ 1994 ）， Peter Agre 在丹麦奥尔胡斯大学的同事，通过低温电子显微镜对这此简单的囊泡的膜进行了检验。当再造的脂质不含有蛋白质时，它的表面是光滑的，而当脂质膜中含有 AQP1 蛋白时，膜的内部就可见到许多直径 0.01 m m 的小洞。 随后， Peter Agre 实验室又对人的 AQP1 基因序列进行了研究。实验显示， AQP1 有四个外显子，编码氨基酸第 1~128 、 129~183 、 184~210 和 211~269 位序列，将内含子分隔为 9.6kb 、 0.43kb 和 0.80kb 三部分。其基困的转录产物约为 3.lkb 。原位杂交 AQP-CHIP 基因定位于人染色体 7p14 处。 AQI-CHIP 与不同物种相似蛋白的 cDNA 序列比较，进化来源相同。
细胞膜水通道的发现（二）
三、 AQP1 的结构 根据 Macey 的研究，汞试剂可通过与半胱氨酸的巯基反应抑制水通道的活性。从 AQP1 的多肽中发现了 4 个半胱氨酸（ 87 、 192 、 152 和 189 位）。每个半胱氨酸被取代为丝氨酸，比较卵母细胞的重组体中突变型和野生型 AQP 对水的通透性。结果只有 E 环的残基没有被汞抑制。在 B 环的相应位置用一个半胱氨酸取代了丙氨酸，这个蛋白显示出了汞敏感的水通透性。而在 AQP1 其它位置的置换未能导致这种现象的发生。这提示这一分子中 B 环和 E 环的相应部分一定形成了沙漏样的水孔通道。 6 个跨膜螺旋表明它们围绕形成一个中心区域，包含 B 环，从细胞质表面浸入细胞膜， E 环从细胞外浸人细胞膜。 AQP1 这样的结构可以解释水通道在水的吸收和分泌两个运动方向上所起的作用。膜上处于反方向相对位置的 B 环和 E 环对构成功能性水选择通透十分重要。 CHIP 两端序列相互关联， B 环（细胞内 76~78 位）和 E 环（细胞外 192~194 位）均有一个 NPA 模序（ asparagine-proline-alanine ）。 E 环的 NPA 靠近汞制剂抑制点 189 位的半胱氨酸。 B 环和 E 环的重叠部分显示出它们形成一个单一的水的孔道向下穿过分子的中心， NPA 的主要成分并列在一起成 180 度相联。 AQP1 是一个四聚体，每一个亚单位有一个中心孔道。 在极高的蛋白质浓度下把再造的 AQP1 蛋白植入到人工合成的膜中。在此条件下， AQP1 蛋白按照膜晶体结构进行了非常显著的对称排列。通过测定水的通透性，证实膜的功能得到了 100% 的保留，这一点更加确信 Peter Agre 推导出的这一结构就是其生物相关性结构。 Peter Agre 教授在巴塞尔和京都工作的同事通过低温电子显微镜和原子能显微镜提供了人类 AQP1 在 3.8? 下的电子密度图，表述了 AQP1 的原子模型。膜双分子层中间的横向剖面图并对单独的一个 AQP1 亚单元进行观察时，通过壁周围排列着的疏水基可以观察到单个的水孔，但是在其它壁上排列着两种 NPA 基序的高糖天冬酰胺。当对其纵向剖面图进行观察时，在两个高糖天冬酰胺间可以看到狭窄的水孔。 像水通道这样不能移动的单独孔是如何允许水快速的通过而不允许质子通过的呢？ Lawrence Berkeley 实验室的 Bing K. Jap 研究了牛科动物红细胞中 AQP1 在 2.2? 溶液中图像，对 AQP1 的水孔选择性地通过水分子而不是其他小分子和离子的机制做了阐述。 AQP1 选择性滤过水有三个原因：第一， AQP1 水孔的直径。 AQP1 分子的沙漏结构由三部分组成：一个细胞外的通道，一个选择性转运水的水孔，一个内部的通道。这些通道其跨度大约只有 20? ，非常狭窄。仅允许单个水分子通过。在这个跨距的顶端附近，通道达到了它的最狭窄的部分，只有 2.8? （大约是一个水分子的直径）。因此，这个孔道的大小只能容纳一个水分子通过；第二，静电排斥。在这个位点上，一个被保存完整的精氨酸的侧链跟在 E 环的 NPA 中心之后并形成一个稳定正电荷，在另一个壁上的保存完好的组氨酸形成另一个部分正电荷，它们一起排斥质子以及 H 3 O + ；第三，对于质子的存在还有另外一道屏障，即单个水分子会产生暂时的偶极旋转同时与并排的两个 NPA 主体的侧链形成氢键。此外，跨越非双分子层的项部的 a 螺旋到达 B 环和 E 环有助于部分正电荷阻碍质子的传导。这也表明了汞是怎样抑制水分子通过 AQP1 的： Cys-189 的侧链沿孔排列，所以如果受到汞的阻挡，通道就会闭塞。
四、水通道家族的分类及其与疾病的关系 水通道的发现开辟了一个新的研究领域。目前，科学家发现水通道蛋白广泛存在于动物、植物和微生物中。在哺乳动物细胞中已发现 13 种亚型（ AQP0-AQP12 ）。值得一提的是， AQP11 和 AQP12 是近期才被确认的水通道亚型。 Agre 等（ 2006 ）在大鼠的肾脏、肝脏、睾丸以及大脑组织中发现了 AQP11 RNA 和蛋白质。 AQP11 在脑组织中特异分布于浦肯野细胞的树突，海马 CA1 和 CA2 区神经元，以及皮层神经元。浦肾野细胞免疫组化显示 AQP11 位于胞质内。 Sasaki 等（ 2006 ）用 BLAST 方法发现了 AQP12 ， Northern blot 方法确定 AQP12 特异表达于胰腺。原位杂交以及 RT-PCR 研究表明 AQP12 选择性分布于胰腺的腺泡细胞。免疫杂交显示 AQP12 并不定位于膜上。 水通道按其功能特异性可分为两类：一类具有高度选择的水通透性，即除水之外不转运其它小分子溶质，如 AQP0 、 AQP1 、 AQP2 、 AQP4 、 AQP5 、 AQP6 、 AQP8 ；另一类具有相对选择的水通透性， AQP3 及 AQP7 对尿素和甘油均具有较高的通透性，而 AQP9 仪对尿素有通透性。 Peter Agre 等（ 2006 ）的研究表明，在爪螗卵母细胞的细胞膜上表达的 AQP11 不能转运水、甘油、尿素或者其他离子。与水通道家族其他亚型相比， AQP11 的功能可能会差别很大。也许 AQP11 代表一个全新的水通道亚家族。 水通道在组织中的分布表明，水通道基因表达异常可能参与某些水平衡紊乱性疾病的发病。 AQP1 是 Colton （ Co ）血型的分子基础： Co 血型抗原是 AQP1 蛋白位于胞外的一个特殊区域。完全缺乏 AQP1 的人产生的突变段有明显意义。三级结构的严重错义是指 38 位残基上的脯氨酸变成了亮氨酸。此基因突变导致了无 Co 表型的产生。在世界范围内已确认了有五个不同的家族完全缺乏 Co 抗原，人数非常少。在没有压力的状态下， AQP1 缺失的人没有临床上异常表现．在临床研究中（ Agre 等 2002 ）， AQP1 缺失的人在 24 小时无液体补充状态下仅能将尿液浓缩至 450mOsm ，而正常人同等条件下可以将尿液浓缩至大于 1000mOsm ，且每晚当睡觉无液体补充时均如此。 AQP1 是水通道家族中唯一在内皮细胞表达的亚型，在肺、肌肉、腹膜等组织的毛细血管以及肾脏直小血管等内皮细胞高表达，并介导渗透压驱动的高效跨膜和跨内皮水转运。另外一些研究发现， AQP1 在乳腺癌、神经母细胞瘤、肺癌以及骨髓瘤等多种肿瘤的血管内皮高表达，故对 AQPl 与肿瘤迁移的研究也逐渐增多。 Verkman 实验室于 2005 年 4 月在 Nature 上发表文章，应用水通道 AQ1 敲除小鼠和细胞培养体系，首次证明细胞膜水通道蛋白在血管生成和细胞迁移中发挥重要作用，证明由细胞膜水通透性决定的跨膜水转运效率会影响细胞迁移行为和相关的生理和病理过程。 Verkman 实验室的后续实验证明， AQP1 能够协助肿瘤细胞迁移、扩散。这些研究表明，高转移性肿瘤表达的 AQPs 具有新功能。 AQP2 是抗利尿激素（ AVP ）调控的水通道蛋白，又称 AQP2-CD （ collecting duct aquaporin) ，由东京医科齿科大学的 Sasaki 教授于 1993 年发现，仅存在于主细胞和内髓部集合管上皮细胞顶膜上。 AVP 由下丘脑和垂体产生，通过作用于肾脏集合管的 AVP 受体 2 （ AVPR2 ）激活 Gs 蛋白，刺激 cAMP 的磷酸化反应，促使 AQP2 移至肾小管集合管的主细胞膜顶部，使水分子从低渗状态的肾小球腔内进入高渗状态。肾源性尿崩症（ nephrogenic diabetes insipidus ， NDI ）是一种多尿综合征，由于 AVP 不能有效地与肾脏的 AVP 受体作用，以致肾小管不能浓缩尿液。 NDI 包括先天性和获得性两种。不到 10% 的常染色体显性或隐性遗传是由定位于常染色体 12q13 上的编码 AQP2 基因突变引起（顾锋等 . 2002 ）。 AQP3 属于水 - 甘油通道亚家族，在小鼠表皮的角化细胞基底层高表达，该层细胞向上分化成角化层，并且形成角化层和真皮层之间的界面。 AQP3 敲除小鼠表皮结构虽无明显变化，但湿润度和弹性明显下降。表皮甘油含量降低近 50% ，屏障功能和损伤修复功能均发生障碍，给 AQP3 敲除小鼠口服获腹腔注射甘油可完全纠正上述所有皮肤功能障碍（ Fujiyoshi 等 . 2002 ）。 AQP4 在大脑和脊髓中广泛表达，特别是在参与形成血 - 脑 屏障的星形胶质细胞周足处以及室管膜和软脑膜上皮高表达。 AQP4 缺失使小鼠对急性水中毒和缺血性脑卒中引起的脑水肿（以细胞毒性脑水肿为主）有保护作用，脑水肿程度减轻，死亡率下降。但 AQP4 缺失对血管性脑水肿的清除产生不利作用。 AQP4 敲除小鼠在化学诱导癫痫模型中发生抽搐的频率和程度显著低于野生对照组，表明 AQP4 参与神经元放电活动（冯学超等 . 2005 ）。 AQP5 分布于肺的 Ⅰ 型细胞、上气道的分泌上皮细胞，在颌下腺、腮腺上皮细胞也有表达。部分肺疾病与 AQP 功能异常相关。肺水肿时，液体首先积聚在支气管周围，继而进入肺间质和肺泡腔。在氧毒性大鼠，肺 AQP1 和 AQP5 在肺水肿时表达下调，推测 AQP 和 AQPs 在急性肺损伤时水的清除中起调节作用。但 AQP1 和 AQP5 作用环节不完全一致； AQP1 主要是清除支气管和脉管周围组织的水分，而 AQP5 则是清除肺泡腔内的水分（陶军等 . 2000 ）。口干症也是一种在临床上较常见的病症，主要见于头颈部放射治疗造成的涎腺损伤，舍格仑综合征及涎腺良性肥大。目前对口干症的治疗除疗效短暂的促唾液剂（如毛果云香碱、环戊六酮及各种唾液代用品）外，尚无其他有效疗法。但运用基因疗法将 AQP5 的基因转染至涎腺组织改变细胞膜对水的通透性是一个可行的办法。 AQP6 存在于集合管泌酸细胞和近曲小管上皮细胞的囊泡中。 AQP6 分布的独特性预示了它可能与其他水通道蛋白有功能上的差别，包括对酸碱平衡的调节。 以上仅对 AQP1-AQP6 与疾病的关系做简要概述。在 AQP 家族中， AQP0 和 AQP2 分布相对集中， AQP11 和 AQP12 的研究处于起步阶段，其他亚型的 AQP 分布都非常广泛：同一组织或器官中可能含有多个 AQP 证型；同一个 AQP 亚型也可分布于多个组织或器官中。这一现象表明，不同亚型的水通道蛋白在功能上是相互影响的。 （摘自 郭昊 , 李学军 . 细胞膜上的水通道 ——2003 年诺贝尔化学奖工作介绍 . 生理科学进展 , 2007; 38(3): 283-289 ） （朱大年 供稿）
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