雷公藤对糖尿病大鼠肾皮质GLUT1 mRNA表达的影响及其意义【摘要】 目的 探讨雷公藤对糖尿病(DM)大鼠肾脏GLUT1 mRNA 表达的影响及其意义。方法 采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法建立DM动物模型。将46只3月龄160~190 g大鼠(雌雄各半)随机分为正常对照组,DM模型组,雷公藤组(6.7 mg·kg-1·d-1) 。第4、8、12周末各组处死4只大鼠并收集标本,记录体重、右肾重、检测血糖、血尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白定量。用RTPCR方法检测肾皮质GLUT1 mRNA表达水平。肾组织行HE、PAS染色。结果 ①与正常对照组相比,DM模型组大鼠造模成功后血糖明显增高(P<0.01),但24 h尿蛋白排泄量无明显增高(P>0.05);4 w时体重、肾重指数、尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白排泄量、肾皮质GLUT1 mRNA表达均明显增加(P均<0.01),12 w时增加更加显著。与DM模型组相比,雷公藤组8 w时血糖、尿素氮、肌酐降低(P均<0.05),24 h尿蛋白排泄量和肾皮质GLUT1 mRNA表达量均明显下降(P均<0.01);12 w时体重增加(P<0.05),肾重指数才明显下降(P<0.01)。②肾组织HE、PAS染色病理学观察:DM模型组光镜下肾小球肥大,系膜细胞增生,系膜基质弥漫性或结节性增多,肾小球、肾小管基底膜增厚,而雷公藤组这些病理改变明显减轻。结论 雷公藤能明显减少DM大鼠尿蛋白排泄量,抑制肾脏肥大、减轻肾脏的纤维化硬化程度。其机制可能是下调GLUT1 mRNA的表达量及功能活性,最终延缓DN的发展。 【关键词】 糖尿病;葡萄糖转运蛋白1;雷公藤 Study on the effects of triptolide on the expression of glucose transporter1 (GLUT1) mRNA in renal cortex of the diabetic rats LIU LiQiu, DONG Hui, ZHOU HaiYan, et al. Urology Department, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, Shandong, China 【Abstract】 Objective To investigate the effects of triptolide on the expression of glucose transporter (GLUT)1 mRNA in the diabetic kidneys,and probe into its mechanism. Methods The rat diabetes model was established by intraperitoneal injection of STZ. Forty six adult Wistar rats (half males and half females),3 months old, were divided randomly into normal control, diabetic model and triptolide treated groups (6.7 mg·kg-1·d-1). Four rats of each group were sacrificed at the end of the 4th, 8th,12th week to collect samples for recordingbody weight,right kidney weight,blood sugar,serum creatinine,blood urea nitrogen,24hour urinary protein excretion. Renal GLUT1 mRNA expression was measured with reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). Renal pathomorphology was observed by HE and PAS staining.Results ① Compared with normal control group, diabetic model group had the significantly increased blood sugar (P<0.01) and had no significantly incresed 24 h urinary protein excretion (P>0.05)at 0 w; had significantly decreased body weight (P<0.01) and the significantly increased kidey weight index,serum creatinine,blood urea nitrogen,24 h urinary protein excretion, renal GLUT1 mRNA expression (P<0.01) at the end of 4th week; so did at the end of 12th week. Compared with model group, triptolide group had significantly decreased blood sugar, serum creatinine and blood urea nitrogen (P<0.05), 24 h urinary protein excretion and renal GLUT1 mRNA expressions (P<0.01) at the end of 8th week;and had significantly increased body weight(P<0.05)and kidey weight index (P<0.01) at the end of 12th week. ②HE and PAS dyeing showed that glomcrulus hypertrophia, mesangial cell proliferation, mesangial matrix diffused and nodular multiplication,thicking of the glomerular and tubular basement membrane of rats inmodel group. In triptolide group these chages alleviated.Conclusions Triptolide can decrease the 24 h urinary protein excretion, inhibite the degree of renal hypertrophy and fibrosis hardening. This might be the mechanism that triptolide can downregulate the synthesis of the expression and activity of GLUT1 mRNA,and ultimately postpone the development of diabetic nephropathy. 糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)代谢异常引起的肾小球硬化,是常见的DM慢性微血管并发症,已成为1型DM死亡率增加的主要原因。有研究表明葡萄糖转运蛋白细胞(GLUT)在DN发病中起着非常重要的作用。而中药雷公藤多甙具有独特的抗炎及免疫抑制作用〔1〕,已用于治疗各种肾脏病多年。对于各种肾病引起的蛋白尿、血尿,如原发或继发性肾病综合征(DN、狼疮性肾病、痛风性肾病等)、慢性肾小球肾炎、IgA肾病等,都取得了良好的疗效。因此,为了探讨雷公藤多苷在DN的可能作用机制,是否与GLUT1 mRNA有关,本研究通过观察雷公藤多甙对肾组织中GLUT1 mRNA表达及其对肾功能和肾脏细胞外基质(ECM)的影响,以探讨GLUT1 mRNA直接介导DN的机制及雷公藤对DM大鼠肾脏的保护作用。 1 材料与方法 1.1 药物与试剂 雷公藤多甙购于三九黄石制药厂。AMV逆转录试剂盒购于Promega公司;Trizol Reagent购于Invitrogen公司。 1.2 实验动物及分组 Wistar大鼠46只,SPF级,3月龄,雌雄各半,体重160~190 g,购自青岛市药检所。动物房室温控制在25~28℃,湿度70%,12 h交替照明。大鼠自由饮水、进食,保持垫料干燥。饲料购自山东省实验动物中心。随机分为正常对照组14只,DM模型组16只,雷公藤组16只(正常进食、饮水)。DM大鼠模型制备是在Wistar大鼠适应性饲养1 w,空腹12 h后,DM模型组(相当体积生理盐水每天1次灌胃)和雷公藤组〔(6.7 mg·kg-1·d-1) 每天1次灌胃〕给予链脲佐菌素(STZ)55 mg/kg(溶解于0.1 mol/L,pH4.5无菌柠檬酸缓冲液中,终浓度为1%)一次性腹腔注射建立DM大鼠模型,正常对照组给予相当体积的枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。注射后48 h后尾静脉血,连续3 d测定随机血糖(ACCUCHEK ACTIVE血糖仪及配套试纸),血糖≥16.7 mmol/L,尿糖定性为()()(尿糖试纸为烟台宝威),确定模型建立并纳入本实验,未达标准者退出模型组。正常对照组大鼠饲养12 w后无1例死亡。DM模型组大鼠有1只未成功而放弃,3只造模第1周内死亡,死亡原因考虑为酮症酸中毒和(或) STZ毒性作用〔3〕。雷公藤组大鼠2只在造模后第1周内死亡,死亡原因同上,1只于饲养第6周死亡,死因不明确。 1.3 生化指标测定 在4、8、12周末,每组随机选出4只大鼠,10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)麻醉,取腹正中切口,暴露腹主动脉并取血2 ml,1 500 r/min离心后取血清,-20℃保存待测。血肌酐、尿素氮由美国LANDMARK公司(型号AGⅡ)测定。血糖采用德国ACCUCHEK ACTIVE血糖仪及配套试纸条测定。 1.4 24 h尿标本的收集 采用金属代谢笼收集,收集时预先将大鼠放入洗净的代谢笼中,收集24 h尿标本,记录尿量后取10 ml,5 000 r /min离心10 min,去除沉渣,于 20 ℃冰箱保存待测,由Beckman synchron cx7型全自动生化仪测定。 1.5 RTPCR半定量测定肾皮质GLUT1 mRNA水平 右肾去除肾周结缔组织后分析天平称重分装后,迅速投入液氮,之后置于-80℃保存待用。按照Trizol试剂盒操作说明提取肾皮质总RNA,逆转录反应成cDNA后续25 μl体系PCR反应。 用primer premier 5进行引物设计。GLUT1上游引物:5'CATGTGCTTCCAATATGTGG 3′,下游引物:5'GTCAGTTTGGAAGAGGTCTC3′,扩增产物312 bp;内参照GAPDH上游引物:5'GCC ATCAACGACCCCTTCATTG 3′,下游引物:5' TGCCAGTGAGCTTCCCGTTC3′ ,扩增产物为598 bp。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为:GLUT1:94℃预变性3 min,94℃变性50 s;56℃退火50 s;72℃延伸1 min,35个循环后,72℃延伸10 min; GAPDH:94℃预变性3 min,94℃变性30 s;56℃退火30 s;72℃延伸30 min,35个循环后,72℃延伸10 min。PCR产物在质量分数1.5%的琼脂糖凝胶电泳上观察拍照,并运用天能分析软件对条带进行光密度扫描,检测各组GLUT1 mRNA扩增产物与其对应的内参GAPDH mRNA扩增产物A值,然后将AGLUT1/AGAPDH的比值进行统计学分析。 1.6 肾脏病理形态学检查及免疫组织化学技术 左肾经肾门冠状面取组织,10%中性甲醛固定石蜡包埋组织连续切片,厚度2 μm,行HE、PAS染色。 1.7 统计学方法 采用SPSS 11.5,计量资料以x±s表示,多组间比较采用方差分析。 2 结果 2.1 各组大鼠一般情况 DM造模成功后,DM模型组和雷公藤组较正常对照组明显多饮多食多尿。所有动物的精神、活动均正常。与正常对照组相比,DM模型组大鼠体重4、8、12周时均明显下降(P<0.01);与DM模型组相比,12 w时雷公藤组体重明显增高(P<0.05)。DM模型组大鼠体重在12 w内呈下降趋势,但与0 w相比无显著差异(P>0.05);雷公藤组大鼠体重呈上升趋势,与0 w相比,12 w时体重明显增加(P<0.01)。见表1。 2.2 各组大鼠肾重指数(肾重/体重)的比较 与正常对照组相比,DM模型组肾重指数在4、8、12 w时均显著增高(P<0.01),雷公藤组肾重指数4、8 w时均显著增加(P<0.01),12 w时明显增加(P<0.05)。与DM模型组相比,雷公藤组肾重指数12 w显著下降(P<0.01)。雷公藤组肾重指数随时间下降具有显著差异(P<0.05)。见表1。 表1 各组大鼠体重和肾重指数的变化(略) 与正常对照组比较:1)P<0.05,2)P<0.01;与DM模型组比较:3)P<0.05,4)P<0.01;与0 w比较:5)P< 0.01;与4 w比较:6)P<0.05;与8 w比较:7)P<0.05 2.3 各组大鼠血糖水平的比较 与正常对照组相比,DM模型组大鼠血糖在0、4、8、12 w时均明显增高(P均<0.01);与DM模型组相比,雷公藤组血糖水平0 w时与之相似(P>0.05),8 w时下降(P<0.05),12 w时下降更加显著(P<0.01)。DM模型组血糖水平12 w内差异不显著(P>0.05)。雷公藤组血糖随时间呈下降趋势,12 w时与0 w时差异显著(P<0.05)。见表2。 2.4 各组大鼠24 h尿蛋白定量的比较 与正常对照组相比,DM模型组大鼠造模成功后0 w无明显的尿蛋白排泄量增多(P>0.05),4、8、12 w尿蛋白排泄量均明显增多(P均<0.01);与DM模型组相比,雷公藤组大鼠药物干预后0 w无明显的尿蛋白排泄量减少(P>0.05),8、12 w时尿蛋白排泄量均明显减少(P均<0.01),但仍明显高于正常对照组(P<0.01)。且DM模型组、雷公藤组4、8、12 w与0 w比较均有显著差异(P<0.01)。见表2。 2.5 各组大鼠血尿素氮及肌酐水平的比较 与正常对照组相比,DM模型组血尿素氮、肌酐在4、8、12 w均明显增高(P均<0.01),雷公藤组血尿素氮、肌酐在4、8 w时均明显增高(P均<0.01),雷公藤组血尿素氮、肌酐12 w时与之差异仍显著(P<0.05);与DM模型组相比,雷公藤组血尿素氮、肌酐8 w时下降(P<0.05),12 w时下降更加显著(P<0.01)。DM模型组内,与4 w相比,12 w时血尿素氮、肌酐明显增加(P<0.05)。雷公藤组血肌酐水平随时间呈下降趋势,在12 w末时与4 w相比降低(P<0.05),但尿素氮12 w内略有下降,但无显著意义。见表3。 2.6 各组大鼠肾组织GLUT1 mRNA表达的比较 与正常对照组相比,DM模型组GLUT1 mRNA表达在4、8、12 w均明显增高(P均<0.01);与DM模型组相比,雷公藤组GLUT1 mRNA表达于8 w时显著下降(P<0.01),12 w时下降更显著(P<0.01)。DM模型组内,与4 w相比,12 w时GLUT1 mRNA表达明显增加(P<0.05)。雷公藤组GLUT1 mRNA表达水平随时间呈下降趋势,在8 w末时已与4 w相比显著降低(P<0.01)。电泳结果见表4和图1。 2.7 各组大鼠肾脏病理形态学观察 DM模型组大鼠肾脏病理示有 DN早期特征性病理改变——肾小球肥大、系膜细胞增生,系膜基质弥漫性或结节性增多,其中主要是胶原蛋白Ⅳ和层黏连蛋白的迅速增多,并且伴有ECM降解功能的减退,最终导致系膜区胶原蛋白Ⅳ和层黏连蛋白的大量沉积,肾小球基底膜(GBM)、肾小管基底膜(TBM)的增厚,肾小管上皮细胞空泡样变性,随系膜基质弥漫性沉积增多,进一步损害肾小球功能,肾小球出现结节性硬化,并具有纤维状撕裂特点,并且伴有肾小管间质的纤维化。雷公藤组与DM模型组相比,肾脏肥大指数减小,同时肾脏系膜细胞增生受到一定程度的抑制,ECM明显减少。见图2。 表2 各组大鼠血糖和24 h尿蛋白定量的变化(略) 与正常对照组比较:1)P<0.01;与DM模型组比较:2)P<0.05,3)P<0.01;与0 w比较:4)P<0.05,5)P<0.01;与4 w比较:6)P<0.01 表3 各组大鼠血肌酐及尿素氮的变化(略) 与正常对照组比较:1)P<0.05,2)P<0.01;与DM模型组比较:3)P<0.05,4)P<0.01; 与4 w比较:5)P<0.05;与8 w比较:6)P<0.05 表4 各组大鼠GLUT1 mRNA表达的变化(略) 与正常对照组比较:1)P<0.05,2)P<0.01;与DM模型组比较:3)P<0.01;与4 w比较:4)P<0.05,5)P<0.01;与8 w比较:6)P<0.05 图1 各组大鼠GLUT1 mRNA RTPCR结果(略) 图2 各组肾脏组织12 w末HE、PAS染色结果(×400)(略) 3 讨论 【参考文献】 |
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