一、芯片的制备
芯片制备的基本原理。
芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备和DNA微集陈列的制备三个方面。
1.支持物的预处理
目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分为两类:实性材料和膜性材料。实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。实性材料需要进行预处理,使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团。在合成寡核苷酸前,这些基因可与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来,合成时在光照下除去光敏保护基团,该活性基团又可以和活化的单核苷酸发生化学反应。另一方面,这些活性基团可与DNA分子中的羟基等基团形成共价结合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等,使其带上正电荷吸附带负电荷的DNA探针。
2.原位合成芯片的制备
原位合成芯片是采用显微光蚀刻(photolithography)技术或压电打印(piezoelectric printing)技术,在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制成。显微光蚀刻技术也称为光引导聚合技术(light-directed synthesis),它不仅可用于寡核苷酸的合成,也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技术(photolithography)与传统的核酸,多肽固相合成技术相结合的产物,是原位合成芯片的主要方法。压电打印法的装置与普通的彩色喷墨打印机相似,所用的技术也是常规的固相合成方法。
3.DNA微集陈列的制备
DNA微集陈列的制备采用的是预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上的方式。
二、样品的准备
样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记等过程。
1.样品的分离纯化
主要从活组织或血液中获得DNA或mRNA,这个过程包括细胞分离,破裂,去蛋白,提取及纯化核酸的过程。
2.样品的扩增
测定时往往需要较多的样品分子,因此对于分离获得的基因组DNA通过PCR技术直接扩增,对于mRNA则需要逆转录,制备cDNA。
3.样品的标记
标记物主要有荧光分子(cy3、cy5)、生物素以及放射性同位素等。带有标记的dNTP(cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP)通过DNA或cDNA扩增的过程,掺入靶分子序列。也可以在制备引物时,掺入标记的核苷酸,扩增靶序列后,使扩增产物末端带有标记物。膜性载体可以用于检测同位素标记的样品。
样品分子标记的质量影响芯片检测的灵敏度,因此,核酸的提取,反转录以及标记等各环节要求严格操作。荧光标记分辨率高于同位素标记,而且可以采用双色,如对照样品标红色,待检样品标绿色,有助于结果分析与判断。
三、分子杂交
芯片杂交是应用标记的待测样品(靶序列)与固定在载体表面的探针进行的复杂过程。
依据探针长度、类型以及不同的目的,确定温度、盐浓度与反应时间。通常采用的条件是:42℃,50%甲酰胺,6×SSC,0.5%SDS,5×Denhardt试剂。也可采用65℃,6×SSC,0.5%SDS,5×Denhardt试剂或者65℃,10%SDS,7%PEG-800。
杂交过程类似Northern或Southern杂交,如封闭液预杂交、杂交、清洗、干燥与检测。
四、检测分析
芯片杂交信号的检测可应用荧光检测法、质谱法、化学发光法、光导纤维法以及生物传感器法。其中激光共聚焦荧光检测法是最常应用的方法:激光从芯片的背面切入,聚焦于芯片与靶溶液的相互作用面,与探针杂交的靶序列标记物被激发产生荧光,经过棱镜聚焦而被检测器检测。样品靶序列与探针严格配对杂交的分子发生强荧光信号,不完全杂交显示较弱的信号。