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农杆菌质粒载体系统 质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti 质粒和 Ri 质粒。Ti质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri 质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。Ti 质粒和 Ri 质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。但实际工作中，绝大部分采用 Ti 质粒。在这里小编也是给大家着重介绍一下Ti质粒的基本知识。 T-DNA区和Vir区 农杆菌质粒是一种能实现 DNA 转移和整合的天然系统。Ti 质粒有两个区域： ①T-DNA 区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域） ②Vir 区（编码能够实现 T-DNA 转移的蛋白）。 其中，T-DNA 长度为 12-24kb 之间，两端各有一个含 25hp 重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的 T-DNA 可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对 DNA 的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA 并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。从而将外源基因导入到宿主的基因组中。 Ti质粒的结构 Ti 质粒(Tumor induced Plasmid) 是根癌农杆菌染色体外的遗传物质， 为双股共价闭合的环状DNA分子， 其分子量为95--156x106 D，约有150-200kb。依据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤种类的不同，Ti质粒可以分为四种类型：章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型或琥珀碱型。
毒性区（vir区）：激活T-DNA的转移 T-DNA区：侵染植物时，从Ti 质粒上被切割，转移到植物细胞中， 带有与肿瘤形成有关的基因。 接合转移区：存在与细菌间进行接合有关的基因 复制起始区：保证Ti 质粒进行自我复制 编码冠瘿碱的合成， 能随机整合到植物的染色体上。 长度一般为1 2-24kb， 是Ti 质粒最重要的部分。 左右边界分别为25bP的重复序列， 其中14bP是核心， 是完全保守的。 右边界对于致瘤必不可少。 T-DNA区域的结构特点及功能
①编码冠瘿碱的合成， 能随机整合到植物的染色体上。 ②长度一般为1 2-24kb， 是Ti 质粒最重要的部分。 ③左右边界分别为25bP的重复序列， 其中14bP是核心， 是完全保守 的。 ④右边界对于致瘤必不可少。 Vir区的结构和功能 该区段上编码的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故也称作致毒区。T-DNA区与Vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti 质粒DNA的三分之一。Vir区段总长度大约35kb，由6个互补群组成，分别命名为VirA、VirB、 VirC、 VirD、 VirE和 VirG 。 Vir区中各个基因之间都是相互联系相互影响的， 缺一不可。 当Vir基因与T-DNA分别位于两个不同的复制子上时，即Vir区与T-DNA区分割开来以后，Vir基因仍然能够为T-DNA提供转移功能区的结构和功能。 天然Ti 质粒载体的缺点 ①分子量太大（200kb），基因工程中难以操作； ②限制性酶切位点太多， 难以找到单一的限制性位点； ③T-DNA区致瘤基因产物使被转化的植物细胞成为肿瘤， 阻碍细胞的分化和植株再生； ④在大肠杆菌中不能复制； ⑤质粒上存在一些对T-DNA转移不起作用的基因。 Ti 质粒的改造 由于野生型 Ti 质粒过于庞大，约 200-800kb，为了便于重组 DNA 操作，研究人员对 Ti质粒进行了改造从而构建一系列合适的 Ti 衍生载体。首先除掉了野生型 Ti 质粒 T-DNA 区的一段 DNA 片段。例如：参与植物生长素和细胞分裂素的基因（这些基因过度表达植物激素，从而破坏受体细胞和激素产量）。此外需在 Ti 质粒上加上 E．Coli 复制起始位点，使得插入外源基因的 Ti 质粒在为一个穿梭载体，不但可在农杆菌中复制，而且便于在 E．Coli中重组操作与保存。 植物转化载体系统 植物转化载体系统（包括一元载体系统和双元载体系统）。人们在研究中发现在 T-DNA 转移过程中，Vir基因并不一定与 T-DNA 位于同一个质粒上，于是通过构建中间载体解决了 Ti 质粒不能直接导入目的基因的困难。大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性，因此研究者可以将 T-DNA 片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的 Ti 质粒上。这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的 T-DNA 引入 Ti 质粒的有效方法。带有重组 T-DNA 的大肠杆菌质粒的衍生载体称为“中间载体”（intermediate vector），而接受中间载体的 Ti 质粒则称为受体 Ti 质粒（acceptor Ti plasmid），受体 Ti 质粒一般是卸甲载体（disarmed vector）。 所谓卸甲载体就无毒 Ti 质粒载体。因为利用野生型的 Ti 质粒作载体时影响植株再生的直接原因是 T-DNA 中 onc 基因的致瘤作用。因此为了使野生型的 Ti 质粒成为基因转化的载体，必须切除 T-DNA 的 one 基因，而“解除”其“武装”，构建成所谓的“卸甲”或称“缴械”载体。 在这种 onc-载体中已经缺失的 T-DNA 部分被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322 取代。这样任何适合于克隆在 pBR322 质粒的外源 DNA 片段都可以与 pBR322 质粒DNA 同源重组，而被其整合到 onc-Ti 质粒载体上。中间载体通常是多拷贝的 E．coli 小质粒，这一点对 Ti 通过体外操作导入外源基因是非常必要的。 一元载体（共整合）系统 有2个独立的质粒，农杆菌Ti 质粒和大肠杆菌中间载体将外源基因装载到小质粒上，然后把载有外源基因的小质粒通过同源重组的方法导入农杆菌的Ti质粒。
双元载体系统 是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti 质粒构成的双质粒系统, 又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移, 故称之为反式载体（trans vecter）。
载体构建完成后就可以进行后续的遗传转化实验操作了。 赛思基因专注于遗传转化和配套的生物信息学服务。 |
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