凡经过体外DNA 重组以后, 都要通过挑取重组子克隆的方法将改变以后的DNA 序列固定下来。通常挑取克隆是一项十分繁琐费时的工作, 特别对于连结效率较低、自连机率高的情况, 通过碱裂解法或煮沸法提取质粒常常是事倍功半; 另外一种情况是重组质粒向农杆菌转化后的检测过程中, 由于提取农杆菌的质粒通常获得的质粒量很少, 且背景不干净, 因此难以对酶切结果作出判断。针对上述情况, 我们在实践中使用了PCR 方法挑取重组子克
隆, 简化了操作程序, 取得了较满意效果。
1 材料与方法
1. 1 菌种与质粒
DH5A大肠杆菌受体菌及植物表达载体pB in438 (含有卡那霉素筛选标记基因) 均由中国科学院微生物所田颖川提供。B21, 32葡聚糖酶基因片段为作者从烟草中分离得到。pBL G为B21, 32葡聚糖酶基因插入pB in438 中所得到的植物表达载体。
1. 2 酶与试剂
限制性内切酶BamH I, SalI, H ind Ë , EcoR I 及T4DNA 连接酶均购自Boeh ringermannhein 等公司。Taq DNA 聚合酶及PCR 反应缓冲液为中科院微生物所田颖川先生实验室自制。
1. 3 PCR 引物
检测B21, 32葡聚糖酶基因的两个引物为: 5 ’端引物: 5’2 GCGGA TCCGACCA TGGCTGCTA TCACACTCC23’; 3’端引物: 5’2 CGGTCGACC TCACA TCTCACTTACGA GA 23’。此引物由上海生物工程有限公司合成。
1. 4 转化菌落的备份及菌落PCR 反应物的制备
将B21, 32葡聚糖酶基因与植物表达载体pB in438 的连接产物转化大肠杆菌DH5A感受态细胞, 并涂布于含卡那霉素(50 Lg·m l- 1) 的LB 培养基上, 37 ℃培养过夜, 待菌落长至1～ 2mm 时, 用灭菌的牙签沾取全部菌落先在预先分格并标记数字的另一块平皿上轻沾一下, 然后在PCR 反应混合液(PCR 反应缓冲液、dN TP、引物、Taq DNA 聚合酶、dH2O ) 中同样轻洗一下, 依次将需挑取的克隆全部在另一块平皿上备份, 并将剩余菌洗入对应的PCR
小管, 加封石蜡油后进行反应。PCR 的反应条件为: 94 ℃预变性2m in; 94 ℃变性lm in,55 ℃复性1m in, 72 ℃延伸1m in, 共30个循环, 将备份平皿放入37 ℃培养至菌落出现, 置4 ℃保存。
2. 1 菌落PCR 挑取重组子克隆的优势
倒置的平皿及底部的编号通常挑克隆中较繁琐的步骤是质粒提取。每一种基因在导入植物或微生物之前都需要进行体外重组构建, 然后通过挑取转化单菌落得到重组子克隆。常规的碱裂解和煮沸法(Sambrook, 1989)均需要经过菌体过夜培养、菌体裂解及乙醇沉淀过程。一般情况下, 在挑取的若干克隆中只有少部分为重组子, 因此提取质粒过程消耗的时间很多, 而利用菌落PCR 挑取重组子克隆的过程则避开了提取质粒的繁琐过程, 只需将挑取的菌落在另一平皿备份) , 再将剩余的菌洗入PCR反应混合液小管中, 即可进行PCR 反应。由于检测重组子对Taq 酶的要求不是很严格, 因此, 自行提取及配制的Taq 酶与缓冲液完全可以满足需求, 这使得实验成本大大降低。一般
PCR 反应所需时间为3～ 4 h, 在这期间, 可以进行其它的实验, 只需在PCR 反应完成后进行电泳检查即可。
根据PCR 反应得到的重组子克隆, 从备份中挑出3～ 5个菌落进行质粒提取及酶切鉴定, 并对正确插入外源片段的重组子克隆及时保存菌种。这大大地减轻了工作量。在农杆菌转化的质粒检测中, 此方法更显出其优越性。由于农杆菌的质粒提取在目前还没有一种较好的方法(贾盘兴, 1992) , 通常采用大肠杆菌质粒提取的方法进行, 只能得到很少的质粒, 且背景很杂，难以正确判断重组质粒是否已导入农杆菌中, 而采用菌落PCR 却能得到非常好的结果(。
2. 2 菌落PCR 过程中的假阳性问题
通常在PCR 反应过程中, 无论是质粒PCR 还是菌落PCR 都会遇到假阳性问题。为减少或避免假阳性, 每次进行PCR 反应所用的0. 5m l 离心管和移液枪头必须是新的、无菌的,无菌双蒸水分成500 Ll 每一小管, 每次都用新的, 不反复使用; 设正、负对照, 以保证在没有模板条件下不产生任何条带; 平时培养良好的、正确的实验操作, 使自己的实验用具不要被污染, 这样就可在一定的程度上避免假阳性机率。如果产生了假阳性, 通常可采取一些识别
方式加以判断。一般重组子克隆的PCR 反应条带比较亮且宽, 形状较规则, 而假阳性的PCR 条带, 多数不太亮或若隐若现, 条带细而不规则, 若与重组子克隆的PCR 条带在一起时, 较容易识别出来。
目前在重组子克隆挑取及鉴定方面已有不少方法, 如酚、氯仿一步抽提法(魏征宇,1993)、快速裂解法、过柱法等。笔者认为菌落PCR 的方法是一种简易而实用的方法, 因为从它得到的结果就可以直观地看出是否有外源片段插入, 而其它的方法必须经过提质粒酶切后方可知是否真有外源片段插入, 因此, 此法对于解除繁重的实验工作将会有很大的帮助。
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