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一、基因疫苗的诞生 疫苗的诞生为人类防治疾病带来了革命性的变化，它的发展主要经历了三代：第一代疫苗是传统疫苗，即弱毒活苗和灭活苗，如鸡新城疫弱毒苗，猪瘟灭活苗，它是直接将无毒或减毒的病原体作为疫苗接种到人或动物体内，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，从而预防疾病的发生；第二代疫苗是基因工程苗，它是通过基因工程，先分离得到具有强烈免疫原性但无毒性的抗原蛋白的编码基因，然后导入表达载体中，再在宿主细胞表达出重组抗原蛋白，经分离纯化后的重组抗原蛋白作为疫苗接种如重组乙肝疫苗；第三代疫苗是基因疫苗。 基因疫苗（genetic vaccine）又称核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗，是在基因治疗（genetic therapy）技术的基础上发展而来的。基因治疗是从20世纪80年代发展起来用于预防和治疗疾病的最具革命性的生物医学医疗技术，其原理是将人或动物的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。1990年Wolff JA等在进行基因治疗试验时，以裸DNA注射作对照，结果意外发现裸DNA可被骨骼肌细胞吸收并表达出外源性蛋白。1992年Tang.DC等首次证明经基因免疫产生的外源性蛋白质——人生长激素可刺激小鼠免疫系统产生特异性抗体，而且加强免疫后抗体效价增加，从而宣告基因疫苗的诞生。 概括起来，基因疫苗就是指将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统产生应答反应，从而达到预防疾病的目的。 二、基因疫苗质粒载体的构建 获得准确的抗原编码基因并将它插入到合适的载体DNA上，是发展基因疫苗的主要工作。 1编码抗原蛋白基因的分离 制备DNA疫苗首先要获得编码抗原的基因，一般选择编码病原体表面糖蛋白的基因。抗原蛋白产生后可在宿主体内正确糖基化，从而诱导对病原体的免疫应答反应；对于易变异的病原体，最好选择各种变型都具有的核心蛋白保守的DNA序列，这样可对各种变异的病原体产生免疫应答反应，避免因病原体变异产生的免疫逃避问题。目前普遍用表达文库免疫（ELI）技术从各种已知或未知的病原体基因组中获得免疫活性基因。ELI是将病原体基因文库中病原体DNA 片段插入特定的质粒中，再利用基因免疫技术筛选病原体基因组中具有免疫保护功能的基因片段。 首先提取出病原体的DNA或RNA，并将RNA反转录成DNA，然后通过PCR得到目的基因的DNA片段，并插入合适的酶切位点以便下一步克隆。 2 目的基因质粒的载体构建 基因疫苗大多采用质粒作载体。一般说来，基因疫苗质粒载体至少包括5个主要的部件：（1）细菌复制子，以便质粒DNA在细菌体内复制扩增，得到大量的拷贝，但不能在宿主细胞（真核细胞）中复制；（2）原核生物选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以筛选含有质粒DNA的阳性细菌克隆（菌株）；（3）真核生物的启动子、增强子、终止子、内含子等转录调控元件；（4）编码抗原蛋白的目的基因序列；（5）多聚核苷酸信号序列，以保证mRNA翻译时适时终止。另外，基因疫苗质粒载体通常含有一段未甲基化的CpG序列，其具有刺激Th1细胞的免疫活性。 三、基因疫苗的免疫方法 1、直接注射法：裸质粒DNA或经脂质体包裹的裸质粒DNA直接从肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内注射。包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏。 2、基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪将包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞。这种方法效率高，免疫应答强烈，但操作复杂，需特殊设备。 3、细菌或病毒携带法：选择一种容易进入某组织器官的细菌或病毒，将其繁殖基因去掉形成繁殖缺陷菌株，然后将质粒DNA转化到该细菌或病毒中，当这些细菌或病毒进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA。 4、口服、喷鼻或滴鼻法。 四、基因疫苗的免疫应答反应和影响因素 质粒DNA在细胞内表达的多肽抗原与宿主的MHCI和MHCⅡ类分子结合后，提呈给免疫活性细胞(ICC)，诱导多种免疫反应（图1）：一是体液免疫反应；二是细胞毒素T淋巴细胞免疫反应；三是辅助T细胞反应。有关抗原蛋白产生的免疫应答机理还不太清楚
影响基因疫苗效果的因素很多，主要有： （1）质粒载体骨架机构：一般说来，质粒中内含子序列、多聚A序列和免疫刺激序列，都会影响免疫效果。 （2）免疫质粒DNA的给药剂量和导入细胞的效率：免疫的剂量越大，进入细胞的DNA就越多，产生的免疫效果越好。 （3）抗原蛋白在宿主细胞的表达效率。 （4）免疫次数、注射方式和给药途径。 五、基因疫苗的优点和存在的问题 与传统疫苗相比，基因疫苗具有以下显著的优越性： 1、质粒DNA非常稳定，易于贮存和运输，使用方便。而且制备简单，容易大量生产，成本低。对于毒性大、危险的病毒，以及难以提取抗原的疫苗，基因疫苗的制备相对安全，容易得多。 2、质粒DNA在宿主体内可较长时间存在，抗原基因在体内持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果可靠。 3、基因疫苗不仅可以产生体液免疫应答，而且可以导致细胞毒素T淋巴细胞激活而诱导细胞免疫，而传统的疫苗只有活苗可诱导细胞免疫，但存在活疫苗的毒力回升的危险。 4、用核心蛋白保守DNA序列制备的基因疫苗对病原体（细菌或病毒）的各变异亚型都可产生免疫应答，从而避免因病原体变异而造成的免疫逃避问题。 5、一个质粒载体可克隆多个抗原基因组成多价苗，从而一种基因疫苗可预防多种疾病。 6、质粒DNA无免疫原性，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应，至少目前没有检测到抗DNA抗体的报道。另外，基因疫苗还不会受机体已有抗体的影响。 作为一类新型疫苗，基因疫苗还有不少需要进一步研究的问题： 1、安全性问题：质粒DNA一般不会整合到宿主细胞的基因组上，目前也未发现插入突变的证据。但不能完全排除少数质粒DNA插入到染色体上引起突变的可能性。一旦整合到基因组中就可能使细胞癌基因激活或抑癌基因失活 2、保护效率问题：目前为止，基因疫苗的免疫效率很难达到百分之百的免疫保护，且存在明显的种属个体差异，这可能与不同动物细胞需要不同启动子、抗原基因、给药方法途径、给药量有关。 3、免疫耐受问题：基因疫苗体内持续表达产生抗原蛋白，可能打破机体本身的免疫平衡，引发免疫耐受。
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