人体诸如肿瘤和遗传性的许多疾病等，往往同基因异常有着密切的关系。早在DNA重组技术之前就有人提出将正常基因顺序导入病人体内进行基因水平治疗的设想。Edward Tatum和Joshua Lederberg在60年代曾提出可利用病毒作基因转移载体的构想，但直到1990年，用基因治疗手段尝试治疗腺苷酸脱氨酶缺乏症（adenosine deaminase deficiency）才成功实现。迄今已报道的基因治疗方案已逾百种。已有300多病人接受了这种新的治疗方式。基因治疗的对象不再局限于遗传病，而被扩展到肿瘤和传染病等多种疾病。其发展相当迅速，前景十分看好，我国学者也在用基因治疗方式治疗血友病方面做了一定工作。目前已积累了一定的经验和教训，有了一些可遵循的操作程序及可供选择的治疗方式。但这种新的治疗方式仍有许多环节需要不断改进和提高。
一、基因治疗的概念和策略
基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因校正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞（target cells）内，他们或与宿主细胞（host cell）染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。
目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。根据所采用的方法不同，基因治疗的策略大致可分为以下几种：
1. 基因置换（gene replacement）：基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。
2. 基因修复（gene correction）：基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。
3. 基因修饰（gene augmentation）又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。
4. 基因失活（gene inactivation）：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。
5. 免疫调节（immune adjustment）：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。
6. 其它：增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性：采用给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损用力。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性GCV药物，由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将CGV转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。
总之，基因治疗的策略较多，不同的方法在实践中各具有优缺点。而基因的治疗本身也并不局限于遗传病的治疗，现已扩展到肿瘤、病毒性疾病等。基因治疗可用于疾病的治疗，也可用于疾病的预防。应该指出的是基因治疗并不是万能的，尚不能取代现有的治疗方法，作为一种新的方法也还有一些需进一步完善的地方，在实践是应相互结合，取长补短，以取得较好的治疗效果。
二、基因治疗的基本程序
基因治疗是在基因工程基础上发展起来的分子生物学技术，它相对于现有其它治疗方法较为复杂。基因治疗的基本过程包括以下主要方面：
（一）目的基因的选择和制备：
基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的目的基因。对遗传病而言只要研究清楚了某种疾病的发生是由于某基因的异常所引起的，其野生型基因就可被用于基因治疗，如利用ADA基因治疗ADA缺陷病。但在现在的条件下，仅此是不够的。可用于基因治疗的基因还需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。很显然某些激素类基因如与血糖浓度相关的胰岛素基因目前尚不能用于糖尿病的基因治疗。在抗病毒和病原体的基因治疗中。所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史和起重要的作用并且该序列是特异的，如针对HBV的HBeAg或X基因等。肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体，肿瘤细胞内往往存在多种基因异常形式，可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生簪，所针对的癌基因或抑癌基因应下该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。
在确定欲选目的基因后，就在制备目的基因。正向表达的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是基因组DNA(genomic DNA)片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)等技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备。
（二）基因的转运
目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。
病毒载体：病毒具有一些独特的性质，如多数病毒可感染特异的细胞；在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此，病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：
1. 将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因。
2. 制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能。
3. 将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。
4. 病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。
非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体，一些具有受体功能的载体也呈现出诱人的前景。
（三）靶细胞的选择
理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，但在目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞，用于转基因的体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中可具体根据目的和条件选择。
（四）细胞转染（tansfection）
将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的“基因的转运”中有基因介绍。目前较多使用的是脂质体法。
在目前的技术状态下，一般而言其基因转染效率很难达到100%。故必须首先将转导细胞和未转导细胞加以区分。这方面的技术发展很快，常用的转导细胞筛选方法有：
利用基因表达产物筛选法：
（1） 标记基因筛选法：在载体上引入一个标记基因，或同时导入标记基因，在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛选标记基因表型，那些已导入外源基因的细胞将存活下来，而未转录的细胞则死于选择性细胞培养基。如在较多的载体中都有neor标记基因存在，若向培养基中加入G418进行选择，最后只有转导细胞存活下来。
（2） 基因缺陷型受体细胞的选择性：以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选择性培养基进行筛选。例如将TK基因导入TK-的靶细胞，转录细胞可在HAT培养基中生长，未转导的细胞则不能在HAT培养基中生长。
（3） 基因共转染技术：将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后得到复合转导的转化子。
分子生物学方法：
外源基因是否真的转入靶细胞必须用分子杂交方法进行证实。常用的方法有原位杂效，Southern杂交和打点杂交。其中主要问题是探针的选择。若靶细胞内原来不存在所转入的目的基因，可选用目的基因作为探针；靶细胞内一般无标记基因存在，故标记基因是良好的探针。探针大小可以是较大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA单链探针分子。PCR方法目前也已用于转导细胞的鉴定，且该法相对简单易行。
（五）外源基因的表达及检测
在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达状况。
三、基因治病的靶向
基因治疗中的靶向问题是基因治疗中亟待解决的问题。逆转录病毒载体是目前治疗中应用较为广泛且效果较好的载体。有关逆转录病毒靶向的研究已取得一些进展，使得基因治疗更为安全和有效。
（一）逆转录病毒转导的细胞类型的选择调节
Mo-HLV是一个可广泛转导多种细胞的病毒，为了使其仅感染某些专一性细胞，必须改变其感染谱。
1、改变Mo-HLV感染谱：
按宿主范围可将Mo-HLV分为三类：单向性：只能感染啮齿类细胞；异向性：可感染除啮齿类动物细胞以外的其它的细胞；双向性：可感染人及啮齿类动物等大多数细胞。感染细胞的类型是由病毒的外壳蛋白env确定的。
（1）病毒与抗体的偶联：为了使逆转录病毒定向感染所需要的靶细胞，可将病毒与抗体偶联，该抗体则针对所需感染细胞上特有的抗原。如使单向感染病毒与抗人MHC-1。MHC-II的抗体偶联或与抗人表皮生长因子的抗体偶联后，可以感染人类细胞。Goud等使用此法使单向病毒感染人的肝细胞，可惜病毒未能整合入肝细胞基因组，可能其中还有其它原因。
（2）病毒外壳蛋白与配体偶联：如将env蛋白与乳糖偶联成去延酸糖蛋白，用此法改造的单向逆转录病毒将不再感染原先的宿主而只感染人的肝细胞，因为只有肝细胞表面上含有去延酸糖蛋白的受体。
（3）改变病毒外壳蛋白的识别序列：已发现env蛋白与被感染细胞受体相识别部位的化学组成，如果改变核表位的基因序列，就可能改变感染细胞的类型，但Etienne等认为有一个潜在的、非病毒原有的表位与细胞受体识别之后不能使病毒内化。一种可行的方法是同时表达原有的env蛋白，就能解决内化问题。
2、使用其它逆转录病毒载体：
牛白血病逆转录病毒，猿免疫缺陷病毒，鼠乳腺肿瘤病毒有组织专一性感染的特点，有些研究组利用其作为载体。Page等采用HIV作为病毒载体，Rizvi等用BLV作载体，Morris等采用MMTV作载体，并构建了MMTV独特的包装细胞，使病毒滴度提高百倍以上，但同Mo-MLV相比，其它病毒的滴度偏低。
3、以嵌合逆转录病毒为载体
逆转录病毒感染谱是由病毒颗粒决定的，如果我们改变病毒颗粒蛋白，即保留毒gagpol基因，而env基因来自另一个逆转录病毒，即可改变感染宿主范围。Laudau等用鸟逆转录病毒和RSV的env基因取代Mo-MLVR env基因，Miller等用长臂猿白血病病毒的env基因嵌合Mo-MLVR成功感染了多种细胞，并取得较高的滴度，Gong等用流感病毒的血凝素取代RSV的env基因蛋白，将血凝素成功地嵌入病毒外壳，并能有效感染人和鸟类细胞。Jane等用泡状口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白，使该病毒颗粒能成功地感染非哺乳动物如Zebra fish细胞，更重要的是这种病毒外壳可耐受超离心而不影响感染效率，因此有利于浓缩病毒，提高滴度。
（二）目的基因组织专一性表达的调节
许多组织专一性表达的调节片段已研究清楚，把这些片段与目的基因一起重组入逆转录病毒可用于基因的靶向表达。
1、肝专一性表达：
肝专一性表达研究较多的是磷酸烯醇式酮酸羧激酶的启动子。McGrane等用了转基因动物技术使该启动子表达外源基因，证明该启动子专一性地在肝和肾等中表达；Hatzoglau等用PEPCK启动子与neo基因或牛生长因子重组入逆转录病毒载体。克隆后经腹腔注射入子宫感染鼠胎肝或注入门静脉并切除部分肝，证实前病毒可整合肝细胞基因组，并持续表达了八个月之久，而且牛生长因子表达量受食物刺激信号的调节。
另一个肝专一性表达的片段是A-胰蛋白酶基因的顺式作用因子。Simon等的研究表明，α-AT基因上游是决定肝专一性表达的片段，（-137～37）为最短的肝专一性表达的片段。Peng等用α-AT的（-730-30）片段与SV40启动子融合驱动人苯丙氨酸羟化酶基因，使其在肝脏专一性表达，为苯丙酮尿症基因治疗奠定了基础。α-FP为肝癌细胞特有的高效表达产物，Watanabe等发现其上游调控区（-3700～3300）决定了α-FP在肝癌中的专一性表达。Huber等将片段与你腺嘧啶激酶基因融合，克隆入逆转录病毒后转染肝细胞，然后给予无毒性原药-阿拉伯糖核苷，只有肝癌细胞才专一性地合成TK，批ara-MF转化成细胞毒性ara-ATP，造成肝癌细胞的死亡，而其它感染了α-EF-TK的细胞不受影响。
2、肌肉专一性表达：
肌肉中高效表达的是肌苷激酶的调控片段。Johnson等发现MCK调控区有两个增强子：一个位于（-1256～1049），决定肌肉和心肌专一性表达，另一个位于第一内含子（738～1599），只决定在心肌的高效专一性表达。Cox等用这两个增强子使Dystrophin在肌肉的表达量增强50倍，完全纠正了mdr鼠肌肉病理变化，而且无副作用，最近，Yao等用2分MCK增强子（-1350～1048）使人凝血因子IX在肌母细胞中得到高效表达。
3、乳腺专一性表达：
在乳腺中专一性表达的基因有β酪蛋白，乳清酸蛋白，鼠乳腺肿瘤病毒，三都调控区中的负调控片段决定他们仅在乳腺组织中表达。
4、黑色素瘤专一性表达：
黑色素瘤特异性表达酪氨酸和酪氨酸相关蛋白。决定酪氨酸专一性表达的片段是在该基因上游（-270～1），决定TRP-1专一性表达的区域为（-640～165），Hart等用上述调控区与Gal报告基因融合，在人与鼠的黑色素瘤细胞中均检测到其表达。
5、胶质瘤专一性表达：
目前已知鞘磷酸碱性蛋白基因上游（-1300～1）片段决定其在胶质瘤细胞中的专一性表达，Miyao等用该片段与HTK基因融合，转染胶质瘤细胞，在1μMganciclovir培养液中，90%胶质瘤细胞死亡，而对照组生长不受影响。
6、肺癌专一性表达：
人表面活性蛋白A是大多数肺癌表达的物质。Smith 等用SPA-1上游（-2600～178）片段驱动HSV-TK基因，转化肺癌细胞株H441，给予ganciclovir后，H441大量死亡。
四、基因治疗的现状和前景
人类细胞基因治疗的临床实验已经开始。进行基因治疗必须具备下列条件：
①选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；②纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；③该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；④具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。近三年来，已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。
1．复合免疫缺陷综合征的基因治疗
1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素Ⅱ（IL－2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入患儿。大约1－2月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25％，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。
2．黑色素瘤的基因治疗
对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte-TIL,即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF／肿瘤细胞和IL－2／肿瘤细胞方案，即分别将IL－2基因肿瘤坏死因子（tumor necrosis ractor, TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL－2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90％的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。
3. 其它遗传病的基因治疗
其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。对于DMD的基因治疗，由于有小鼠动物模型，也取得一定进展。例如1993年法国将Ad-RSVmDys（腺病毒－罗斯病毒小肌营养不良蛋白基因重组体）注入小鼠肌内成功。即用腺病毒为载体，与小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因的cDNA重组，在RSV启动子启动下，作肌肉注射，证明可在mdy小鼠肌肉表达，此外，对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。 我国复旦大学等单位对乙型血友病的基因治疗也进行了有意义的探索，他们在兔模型的基础上，将人第Ⅸ因子基因通过重组质粒（pcmvix）或重组反转录病毒（N2CMVIX）导入自体皮肤成纤维细胞，获得可喜的阶段性成果，相信不久的将来，基因治疗会在我国取得成功。
4. 反义技术
又称反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides）技术，是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段,使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的、用反义DNA已对某些癌症进行临床试验。这类反义技术只能认为是一种从基因水平进行治疗的技术，它们以不同方式，在DNA复制、转录和翻译水平发挥作用。由于它们的分子量低，故而有潜力进入靶细胞，但其临床稳定性、毒性、细胞通透性等各方面都需要进一步研究。
5．药物靶向治疗（drugs targeting）
此法机理可概括为病毒导向酶的药物前体治疗（virus directed enzyeme prodrug therapy,VDEPT），即用反转录病毒载体的外源基因转移到细胞内.该基因编码一种酶，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒素复合物。带有这一基因的病毒载体只在特殊组织或肿瘤细胞中而不在正常细胞中表达。例如，胞嘧啶脱氨酶（cytosine
deaminase）可将无害的5－氟胞嘧啶（5-fluorocytosine,5-FC）转变为细胞毒素5－氟胞嘧啶（5-fluorocytosine,5-FC）。此病毒可感染正常细胞和癌细胞，但将该酶基因连接到一种“分子开关”后，则只能在肿瘤细胞中表达。Sikora等设计一个“嵌合小基因（chimeric minigene）”，即将酶基因连接到erbB2基因启动子的下游，此启动子活性增强，使erbB2在乳腺癌细胞中过度表达。此时，药物5－FC注入细胞后即转变为5－FU而致癌细胞死亡。而当5－FC给予含有此嵌合基因却无erbB2表达的细胞时，亦无药物前体活性（图14－5）。这一基因治疗的新策略，可有可能使人对肿瘤等不同疾病进行基因治疗。
目前已批准治疗的病例约120例，其中约110例为肿瘤，遗憾的是，除黑色素瘤有些苗头外，全都未能成功。治疗了10余例单基因病，除ADA缺乏症和乙型血友病有一定疗效外，其余都还在实验阶段。但人们再也不怀疑基因治疗不仅可能办到，而且指日可待。
五、基因治疗存在问题与伦理学
从前节叙述中，已可看出基因治疗的研究与实践中存在着若干重要问题。
1．导入基因的稳定高效表达
外源基因转移入病人体内细胞表达，首先与转移方法有关。化学和物理方法所导入的基因效率低，自然表达也差。选择适当的受体细胞，也是为了导入基因能稳定高效的表达。骨髓作为受体细胞使用最多。反转录病毒载体介导基因，只能对分裂状态时的细胞进行传染，因此采取如5－FU处理，使细胞分裂增强，再用含有目的基因病毒颗粒传染可获较好效果。所以，对骨髓细胞培养、干细胞纯化、培养时使用造血因子等方法，可增加基因稳定高效表达。
2．导入基因的安全性
基因治疗的安全性应确保不因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异，这是因为采用反转录病毒载体而引起的问题。因此，应构建相对安全的反转录病毒载体。至于引起插入突变可能失活一个重要基因，或更严重的激活一个原癌基因，这个问题的危险程度到底有多大目前仍不清楚，但至今的实践表明尚未见明显严重问题。
为安全有效地进行基因治疗，任一方案的实施，都要根据严格的技术规程与标准，由有关的行政管理部门批准实施。
与安全性相联系的就是生殖细胞基因治疗。虽然在人类尚未实施，但在动物实验已获成功，这就是转基因的动物出现。这一事实既给人类生殖细胞基因治疗带来了希望，同时也使人们耽心这种遗传特征的变化世代相传，将给人类带来的是福还是祸。因此，许多科学家不仅对此持慎重态度，还有的持反对态度，也就是基因治疗可能具有的潜在危险性。
3．基因治疗与社会伦理道德
体细胞基因治疗是符合伦理道德的，但试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过遗传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域。从历史上看，科学的发明创造对人类生存发展的影响极其深刻，故遗传学发展到今天，可以进行基因治疗，应该说是符合伦理道德的。重要的问题是取得社会的理解配合。首先是病人及其亲属的配合。因此，宣传基因治疗的科学性与安全性以及人类健康的重要性，以提高人们的认识，同时建立并完善医疗法制与措施也是必要的。
为安全计，在临床试验之前，必须在动物研究中达到三项基本要求：
①外源的基因能导入靶细胞并维持足够长期有效；
②该基因要以足够的水平在细胞中表达；
③该基因应对细胞无害。
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