纤维素酶制剂
本品系由长柄木霉代谢生产的纤维素酶制剂，它能水解天然纤维素，生成纤维寡糖，纤维二糖和葡萄糖。本产品为食品级产品。
酶活（最高等级产品）：
综合酶活（滤纸FPA）≥1.8万u/ml
内切酶活（Cx，CMC）≥27万u/ml
外切酶活（C1，脱脂棉）≥0.8万u/ml
二糖酶活（Cb)≥0.6万u/ml
可根据用户要求降低酶活。
反应物中二糖的累积会抑制酶解过程，本品使用温度为30°C-60°C，最佳50°CPH4.0-5.5，最佳4.8。一般情况下，加量为底物重量的万分之零点五即可有效，请用户根据试验确定最佳用量。
本品为深色液体制剂，比重：1.18-1.20g/ml，标准包装12kg/桶。产品存放于阴凉干燥处，每三个月酶活损失小于5%。
本品对人无伤害，如不慎沾染皮肤，净水冲洗即可。
质量标准：符合中华人民共和国行业标准QB1805.1-93对食用酶制剂的卫生要求。
检测方法标准：
重金属：中华人民共和国标准《食品添加剂中重金属限量试验法GB8451-87》
酶活检验：中华人民共和国行业标准《工业酶制剂通用试验方法QB/T1803-93》
包装：中华人民共和国行业标准《工业酶制剂通用检验规则和标志、包装、运输、贮存QB/T1804-93》。
纤维素酶活性的检测
目的
本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。本方法适用于各种固体和液体纤维素酶制剂。
说明
本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理
纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。1950年Reese提出了C1-Cx概念。C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。再由Cx最终催化形成还原性单糖。而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)。这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称CBH）。这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。
据上述理论，分别设计以滤纸（filterpaper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
纤维素酶类活性的定义
Ⅰ1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。
Ⅱ1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解50mg的脱脂棉球产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个C1酶活力单位。
Ⅲ1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个Cx酶活力单位。
Ⅳ1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1%水杨素溶液产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个Cb酶活力单位。
程序
1.试剂和仪器
本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 无水醋酸钠 1.8 无水亚硫酸钠 1.12 热干燥箱80±1℃ 1.2 冰醋酸 1.9 叠氮化钠 1.13 722型分光光度计 1.3 3，5-二硝基水杨酸(DNS) 1.10 Ⅰ定性滤纸 1.14 分析天平（感量0.1㎎） 1.4 无水葡萄糖 Ⅱ脱脂棉球 1.15 一级玻璃制品 1.5 无水酒石酸钾钠 Ⅲ羧甲基纤维素钠 1.16 冰箱 1.6 氢氧化钠 Ⅳ水杨素 1.7 重蒸苯酚 1.11 水浴锅(恒温)50±0.5℃ 2.试剂的制备
2.10.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
使用是以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
2.2DNS显色剂:
溶液A:称分析纯的NaoH104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3,5－二硝基水杨酸。
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
将A、B溶液混合，加入1200ml水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。
2.3ⅢCMC（1%）准确称取1.000g羧甲基纤维素钠用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100ml。
Ⅳ水杨素（1%）准确称取0.25g水杨素用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至25ml。
2.4标准葡萄糖溶液的配制
无水葡萄糖80℃烘干至恒重，准确称取100mg溶于100ml水中，加1mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。
2.5酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。
3.标准曲线的绘制
3.1取7支带有15ml刻度的试管，按下表取试剂
试管号 0 1 2 3 4 5 6 取标准葡萄糖溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 葡萄糖的量（mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 DNS显色剂（ml） 2 2 2 2 2 2 2 沸水浴 10min 定容（ml） 15ml OD550 3.2上述过程同时进行三个平行测试，测得OD值与葡萄糖mg数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线相关系数r≥0.999。
4.分析程序
ⅠFPA活力单位的测定
4.1取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液，再加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。
4.2取其中3支作为测定管，各加1×6cm滤纸条，充分浸泡置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.3另一支作为空白管同时置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.4然后分别加入DNS显色液2ml，空白管同时加1×6cm滤纸条。
4.5放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。
ⅡC1活力单位的测定
4.1取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液，再加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。
4.2取其中3支作为测定管，各加50mg的脱脂棉球，充分浸泡置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.3另一支作为空白管同时置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.4然后分别加入DNS显色液2ml，空白管同时加50mg的脱脂棉球。
4.5放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。
ⅢCx活力单位的测定
4.1取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液。
4.2取其中3支作为测定管，各管再加1.8mlCMC（1%），另一支作空白管，同时加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。然后置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.3然后分别加入DNS显色液2ml。
4.4放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。
ⅣCb活力单位的测定
4.1取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液。
4.2取其中3支作为测定管，各管再加1.8ml水杨素（1%），另一支作空白管，同时加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。然后置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.3然后分别加入DNS显色液2ml。
4.4放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。
5.活性的计算
5.1将测得的各平行样求OD值的均值。
5.2计算纤维素酶类的活性单位依据以下公式
纤维素酶活力=U/g(ml)
式中x：为样品OD值的平均值
b和a由葡萄糖浓度和相应的OD值通过回归方程求的
n：酶粉（液）的稀释倍数
T：酶促反应的时间
0.2：所加酶液的量
β-葡聚糖酶活性的检测
目的
本检测方法是用来确定本公司β-葡聚糖酶的催化活性。本方法适用于各种固体和液体β-葡聚糖酶酶制剂。
说明
本方法适合于β-葡聚糖酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。原理
β-葡聚糖是谷物中的一种重要的非淀粉多糖，它是一种非分支多糖，主要由纤维三糖和纤维四糖单位组成，其中包括70%的β－（1→4）糖苷键和70%的β－（1→3）糖苷键。由于β－（1→3）键的存在，使β－葡聚糖分子形状不规则，表现出水溶性，同时β-葡聚糖具有一定的粘性。β－葡聚糖酶（EC.3.2.1.6）水解内切β－1，3（4）－D－葡聚糖苷键。释放出的还原性双糖基因与3,5-二硝基水杨酸（DNS）发生反应，产生颜色变化，这种变化与释放的还原性双糖的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在540nm的光吸收值查对标准曲线（以麦芽糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定酶的活力单位。
β-葡聚糖酶活性的定义
1g酶粉（或1ml酶液）于50℃pH5.0条件下每分钟水解1%β-葡聚糖溶液产生1微克麦芽糖的酶量定义为一个β-葡聚糖活力单位。
程序
1.试剂和仪器
本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 无水醋酸钠 1.6 单水麦芽糖 1.11 计时表 1.2 冰醋酸 1.7 氢氧化钠 1.12 分光光度计 1.3 大麦β-葡聚糖（sigma公司产品,粘度：24cSt） 1.8 苯甲酸 1.13 沸水水浴器 1.4 3,5-二硝基水杨酸（DNS） 1.9 无水乙醇 1.14 一级玻璃制品 1.5 四水合酒石酸钾钠 1.10 水浴锅 1.15 振荡混合器 2.试剂的制备
2.10.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
使用是以A：B=3：7的比例混合，低温冷藏备用。
2.21%的β-葡聚糖溶液的配制
准确称取0.25gβ-葡聚糖放入100ml锥形瓶中，加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。加20ml无离子水混合15分钟，盖紧塞子在沸水中煮5分钟，放置室温自然冷却，或用自来水流水降温。将已冷却到室温的底物溶液倾入一只25ml容量瓶中，加入2.5ml1M醋酸缓冲液（pH5.0），并用无离子水定容到25ml。
2.33,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
称取30g四水合酒石酸钾钠放入500ml锥形瓶内，加16gNaOH，加50ml无离子水，缓慢加热溶解，溶液变清澈后逐渐加入1g3,5-二硝基水杨酸，直至彻底溶解，冷却到室温，用无离子水定容至100ml。避光，避CO2保存，操作中戴手套。
2.40.1%苯甲酸
0.1g苯甲酸加入大约80ml无离子水中溶解，用无离子水定容至100ml。
2.510mg/ml标准麦芽糖溶液
称1g麦芽糖（恒重）溶于80ml0.1%苯甲酸溶液中，彻底溶解后，转移到100ml容量瓶中，用0.1%苯甲酸溶液定至100ml，配好的溶液可以在4℃保存三个月。
2.6酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH5.0醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。
3.标准曲线的绘制
3.1制作标准曲线做5个标准,准备一系列干净试管，每个稀释浓度做3个平行管，按下表取试剂
试管号 0 1 2 3 4 5 取麦芽糖原液体（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml） 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0 麦芽糖实际含量（mg/ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 移取稀释液至新管（ml） 0 1 1 1 1 1 蒸馏水（ml） 2 1 1 1 1 1 麦芽糖的量（mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 50℃保温 10min DNS显色剂（ml） 2 2 2 2 2 2 沸水浴 5min 蒸馏水（ml） 10 10 10 10 10 10 OD540
3.2测得OD值与麦芽糖mg数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线相关系数r≥0.999。
4.分析程序
4.1对于每一个被测酶样品，取1ml底物溶液置于四支试管(1ml/管),三支供测试酶活性，一支作空白,50±0.5℃保温2-3分钟.
4.2加1ml酶稀释液向三个测试管中，空白管中加1ml无离子水代替酶稀释液。
4.3四支试管均于50℃反应10分钟。
4.4取出后每管加2mlDNS试剂,具塞,沸水煮5分钟。
4.5冰浴冷却后，加10ml无离子水，充分混匀。
46于540nm测OD，用空白管调零。
5.计算
5.1将测得的各平行样求OD值的均值。
5.2计算酶的活性单位依据以下公式
β-葡聚糖酶的活力=U/g(ml)
式中x：为样品OD值的平均值
b和a由麦芽糖浓度和相应的OD值通过回归方程求的
n：酶粉（液）的稀释倍数
10：酶促反应的时间
F：底物校正因子（1.047）通常由底物提供厂家标明
W：酶样品的重量（1g或1ml）
半纤维素酶活性的检测
目的
本检测方法是用来确定本公司半纤维素酶的催化活性。本方法适用于各种固体和液体半纤维素酶酶制剂。
说明
本方法适合于半纤维素酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理
半纤维素被定义为碱溶性植物细胞壁的一类多糖，其中包括木聚糖、葡甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖等多糖成分。木聚糖是半纤维素中最丰富的一种，植物界也分布最广。本法用半纤维素酶水解底物产生还原糖（以木糖计）与3,5-二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对木糖标准曲线可以确定还原性糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。
半纤维素酶活性的定义
1g酶粉（或1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生1微克还原糖（以木糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。
程序
1.试剂和仪器
本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 无水醋酸钠 1.6 四水合酒石酸钾钠 1.11 计时表 1.2 冰醋酸 1.7 氢氧化钠 1.12 分光光度计 1.3 木聚糖（sigma公司产品） 1.8 苯甲酸 1.13 沸水水浴器 1.4 3,5-二硝基水杨酸（DNS） 1.9 无水乙醇 1.14 一级玻璃制品 1.5 木糖 1.10 水浴锅 1.15 振荡混合器 2.试剂的制备
2.10.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
使用是以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
2.21%木聚糖溶液的配制
准确称取1.000g木聚糖用醋酸缓冲液（pH4.8）溶解并定容到100ml。
2.33，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
称取30g四水合酒石酸钾钠放入500ml锥形瓶内，加16gNaOH，加50ml无离子水，缓慢加热溶解，溶液变清澈后逐渐加入1g3，5-二硝基水杨酸，直至彻底溶解，冷却到室温，用无离子水定容至100ml。避光，避CO2保存，操作中戴手套。
2.4标准木糖溶液的配制（1mg/ml）
木糖80℃烘干至恒重，准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。
2.5酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。
3.标准曲线的绘制
3.1取7支带有15ml刻度的试管，按下表取试剂
试管号 0 1 2 3 4 5 6 取标准木糖溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 木糖的量（mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 50℃保温 10min DNS显色剂（ml） 2 2 2 2 2 2 2 沸水浴 10min 定容（ml） 15ml OD550 3.2上述过程同时进行三个平行，测得OD值与木糖mg数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线相关系数r≥0.999。
4.分析程序
4.1对每个酶样须做三个平行，取4支试管各加0.2ml酶液
4.2其中3支做测试管，各加入1.8ml的1%木聚糖底物，另一支做空白管，加入1.8ml的pH4.8的醋酸缓冲液。
4.3四支试管均于50℃反应60分钟。
4.4取出后每管加2mlDNS试剂,具塞,沸水煮10分钟。
4.5冰浴冷却后，补水定容至15ml，充分混匀。
46于550nm测OD，用空白管调零。
5.计算
5.1将测得的各平行样求OD值的均值。
5.2计算酶的活性单位依据以下公式
半纤维素酶的活力=U/g(ml)
式中x：为样品OD值的平均值
b和a由木糖浓度和相应的OD值通过回归方程求的
n：酶粉（液）的稀释倍数
60：酶促反应的时间
5：吸取了0.2ml酶液
果胶酶
本产品为含高果胶酶酶活的固体粉末制剂，可以单独或与其它酶类共同发挥作用，降解果胶质，生成半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸等。在降低汁液粘稠度，澄清汁液，提高出汁率等方面效果显著。
本产品采用黑曲霉菌，经液体深层发酵精制而成，该菌被美国食品与药品监督局和中国食品卫生管理当局认定为无毒副作用，可用于食品生产的菌种，本产品为食用级产品，符合相关国际国内标准。
使用方法
一、将本制剂用适宜的工艺水溶解后加入制好的果汁中，搅匀，常温静置12-24小时，即可澄清果汁。按照水果品种的不同，本公司推荐用量是果汁的0.0001％—0.001％，请用户根据小试确定最佳用量。
二、本制剂最佳使用条件为：PH3.2-5.0，温度10-50°C。
三、果胶酶酶活≥60万u/g。
贮藏包装
一、本品贮藏于干燥阴凉处。
二、每三个月酶活损失小于5%。
三、本品标准包装为0.3公斤／瓶。
质量标准：符合中华人民共和国行业标准QB1805.1-93对食用酶制剂的卫生要求。
检测方法标准：
重金属：中华人民共和国标准《食品添加剂中重金属限量试验法GB8451-87》
酶活检验：中华人民共和国行业标准《工业酶制剂通用试验方法QB/T1803-93》
包装：中华人民共和国行业标准《工业酶制剂通用检验规则和标志、包装、运输、贮存QB/T1804-93》。
果胶酶活性的检测
目的
本检测方法是用来确定本公司果胶酶的催化活性。本方法适用于各种固体和液体果胶酶制剂。
说明
本方法适合于果胶酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理
果胶物质主要存在于植物初生壁和细胞中间，果胶物质是细胞壁的基质多糖。果胶包括两种酸性多糖（聚半乳糖醛酸、聚鼠李半乳糖醛酸）和三种中性多糖（阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖）。果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶，果胶酶水解果胶主要生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量,从而测定果胶酶活力。
果胶酶活力单位定义
1g(或1ml液体酶)酶粉,于50.0℃、pH3.5条件下,每分钟催化果胶水解生成1微克半乳糖醛酸的酶量为一个活力单位。
程序
1.试剂和仪器
本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 醋酸 1.6 硫代硫酸钠 1.2 碘 1.7 碳酸钠 1.3 碘花钾 1.8 可溶性淀粉 1.4 浓硫酸 1.9 水浴锅 1.5 果胶（sigma公司） 1.10 碘量瓶 2.试剂的制备
2.1pH3.5的酸水
用醋酸将蒸馏水调至3.5
2.21%果胶溶液：
准确称取分析纯果胶1g，用酸水溶解煮沸，冷却后过滤，定至100ml。
2.20.1N碘液：
准确称取碘化钾5g，用蒸馏水溶解后，加入2.54g碘，溶解后定容至100ml。
2.30.025mol/L硫代硫酸钠：
准确称取6.2g硫代硫酸钠，加蒸馏水后定容至1L
2.40.5%可溶性淀粉指示剂：
准确称取可溶性淀粉0.5g放入沸水中消煮至透明。
2.51M碳酸钠溶液：
准确称取10.6g碳酸钠，定容于100ml的水中
2.62N硫酸：
吸10ml的浓硫酸倒入170ml的水中
2.7酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，定容至100ml，于50℃水浴浸取1小时，过滤，滤液为供试酶液。则该酶已经稀释100倍。
3.分析程序
3.1取1%果胶酶10ml加入5ml酶液和5ml蒸馏水（PH3.5），在50℃水浴中保温反应1小时。
3.2取出后加热煮沸2~3min，冷却后，补水至20ml。
3.3取5ml反应液于100ml碘量瓶中，加1M碳酸钠溶液1ml，0.1N碘液5ml，摇匀，具塞，于室温暗处下放置20min。
3.4取出后加2N硫酸2ml，立即用0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，加1ml0.5%可溶性淀粉溶液，继续滴定至蓝色消失为止。
3.5空白试验以煮沸失活的酶液或蒸馏水代替酶液进行滴定。
3.6每个酶样最少做两个平行样。
4.计算
4.1将测得的各平行样求OD值的均值。
4.2计算酶的活性单位依据以下公式
酶的活力=U/g(ml)
式中：A：样品滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。
B：空白滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。
N：硫代硫酸钠摩尔浓度。
0.5：1当量硫代硫酸钠相当于0.5当量半乳糖醛酸。
20：反应液总体积
51：酶液体积以1ml计
52：吸取反应液
n：稀释倍数
W：酶粉重量g或酶液体积ml
酸性蛋白酶
一、和氏璧酸性蛋白酶是从筛选的黑曲霉经受控发酵过程获得的食品级改进型酸性蛋白酶，它能在PH值为酸性的条件下水解蛋白质，其使用于酒精、白酒、果酒、啤酒、黄油以及酱油的生产，可澄清发酵醪液和成熟醪液。增强酵母生长，得到更快的发酵速度，更高的产品收率。在啤酒生产中应用，还能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。
二、外观：棕色液体；PH：3.5-4.5；比重：1.18-1.20g/ml。
酶活定义：
1g固体酶粉（或1ml液体酶），在一定温度和ph值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力，以u/g（u/ml）表示。
PH=3.5时，酶活≥5万u/ml
三、在发酵醪液和发酵阶段使用本品，使用量根据发酵底物和效果要求不同,根据实验取得的数据而定，推荐实验的初始添加量从醪液的百万分之一开始。对大多数谷物和果汁醪液来说适宜加量在百万分之二至十万分之一之间，为获得更好的效果而增加使用量不会伤害食品品质。
四、PH的影响
最佳PH范围：2.5-3.5
有效PH范围：2.5-6.0
PH稳定范围：3.0-5.0
温度的影响
最佳温度范围：45℃-50℃
有效温度范围：＜55℃
稳定温度范围：10℃-25℃
五、本品为液体制剂，标准包装为60kg/桶，本品存放于阴凉干燥处，温度为25℃时，每六个月酶活损失小于5%。
质量标准：符合中华人民共和国行业标准QB1805.1-93对食用酶制剂的卫生要求。
检测方法标准：
重金属：中华人民共和国标准《食品添加剂中重金属限量试验法GB8451-87》
酶活检验：中华人民共和国行业标准《工业酶制剂通用试验方法QB/T1803-93》
包装：中华人民共和国行业标准《工业酶制剂通用检验规则和标志、包装、运输、贮存QB/T1804-93》。
蛋白酶活性的检测
目的
本检测方法是用来确定本公司蛋白酶的催化活性。本方法适用于各种固体和液体蛋白制剂。
说明
本方法适合于蛋白酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理
蛋白酶的水解底物很广泛，对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
蛋白酶活力单位定义
在40℃条件下,每分钟水解酪素产生相当于1μg酪氨酸所需的酶量,规定为一个酶活力单位。
程序
1.试剂和仪器
本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 酪素 1.6 磷酸 1.11 磷酸二氢钠 1.16 水浴锅 1.21 分光光度计 1.2 三氯乙酸 1.7 浓溴水 1.12 乳酸 1.17 试管 1.22 一级玻璃制品 1.3 碳酸钠 1.8 浓盐酸 1.13 乳酸钠 1.18 滤纸 1.23 振荡混合器 1.4 钨酸钠 1.9 硫酸锂 1.14 硼酸钠 1.19 移液管 1.5 钼酸钠 1.10 磷酸氢二钠 1.15 氢氧化钠 1.20 计时表 2.试剂的制备
2.1福林试剂的制备：
于200ml烧瓶回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钼酸钠（Na2MO4·2H2O）25g蒸馏水700ml,85%磷酸50ml,浓盐酸100ml,小火回流10小时，去除冷凝器后加入硫酸锂（Li2SO4）50g,蒸馏水50ml和数滴浓溴水摇匀，在通风橱内再进行煮沸15分钟，以去除多余的溴（冷后若仍有绿色需再加溴水，再煮沸去过量的溴）。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，混合均匀过滤。试剂呈金黄色贮于棕色试剂瓶内。使用时以1份原福林溶液与2份蒸馏水混匀（即为福林工作液）。
2.2缓冲液的制备：
2.2.1乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
2.2.2磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶
准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12Ｈ2Ｏ）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2Ｈ2Ｏ）0.5g,加水定容至1000ml
2.2.3硼酸缓冲液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶
甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。
2.30.4mol/L碳酸钠溶液：
准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.
2.40.4mol/L的三氯醋酸液：
准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml
2.50.5mol/L的NaOH：
准确称取2gNaOH溶解并定至100ml
2.610.00mg/ml酪素溶液
称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.
2.7100μg/ml酪氨酸标准溶液
2.7.1准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,用1mol/L的盐酸60ml溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.
2.7.2吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/mlL-酪氨酸标准溶液.
2.8酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上液倒入容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。
3.标准曲线的绘制
3.1L-酪氨酸标准溶液按下表配制。
试管号 0 1 2 3 4 5 取100μg/ml酪氨溶液（ml） 0 1 2 3 4 5 蒸馏水（ml） 10 9 8 7 6 5 酪氨酸实际浓度（μg/ml） 0 10 20 30 40 50 3.2分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。
4.分析程序：
4.1先将酪素溶液放入40+0.2℃恒温水裕中，预热5min
4.2取4支试管，各加入1ml酶液
4.3取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1ml酪素，摇匀，40℃保温10min
4.4取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。
4.5静置10min，过滤沉淀
4.5各取1ml滤液分别加0.4mol/L的Na2CO35ml，福林试剂1ml。在40℃显色20min。680nm处测OD值。以空白管调零点。
5.计算
5.1将测得的各平行样求OD值的均值。
5.2计算酶的活性单位依据以下公式
蛋白酶的活力=A×K×4/10×nU/g(ml)
A：样品平行试验的平均OD值
K：吸光常数
4：反应试剂的总体积
10：酶解反应时间
n：酶液稀释总倍数
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