载体与目的基因的酶切与连接

精彩教师之家 2012-04-20

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载体与目的基因的酶切与连接

1.末端结构

对载体进行酶切处理，要注意酶切片段的末端结构以及黏性末端的碱基组成，载体与插入DNA的连接方式有如下几种：

（1）用同一种限制酶切割载体和插入DNA，二者能正确连接，但不能确定方向(见图1）；

（2）用不同限制酶切割（同尾酶），所得单链突起能互补，二者能正确连接，但不能确定方向（见图1）；

载体与目的基因的酶切与连接

（3）用不同或相同的限制酶切割载体和插入DNA形成平末端，能连接但连接效率低，而且不能确定方向（见图2）；

（4）用不同的限制酶（非同尾酶，双酶切）切割载体和插入DNA，而且形成不同的黏性末端，能连接，也能确定方向，这种模式被广泛应用（见图3）。

2.脱磷酸化处理（防止载体自连的一种方法）

如果载体仅仅用一种限制酶切，在与插入DNA连接的时候，也能进行自我连接，因此有必要将载体DNA末端进行脱磷酸化处理，以防止载体自连。当脱磷酸化的载体与插入DNA连接后，磷酸部位不能形成磷酸二酯键而产生缺口，具有这种缺口的质粒转入大肠杆菌后，利用大肠杆菌修复酶系统修复完成。对于双酶切形成不同黏性末端结构的载体和DNA连接，可不进行脱磷酸化处理。