转：慢病毒载体简介

摘要： 慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链 RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整

慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链 RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后 的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNAi干扰。
慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感 染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒 载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬 细胞等。
慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射（Kafri, T., U. Blomer, D.A. Peterson, F.H. Gage, and I. M. Verma. 1997. Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors. Nat. Genet. 17:314-317）。

慢病毒载体应用

• 将目的基因/RNAi基因转入难以转染的细胞，比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞
• 将目的基因/RNAi基因转入动物组织，以期获得长期表达
• 构建稳定表达目的蛋白/RNAi的细胞系，再用ex vivo的方法导入动物体内
• 基因治疗
• 转基因动物
• 基因敲除
• 药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用
• 快速建立生产目的蛋白的细胞系，非常有前途的真核细胞表达方法

本元正阳慢病毒载体系统
本元正阳生产的慢病毒载体属于“第三代”慢病毒载体，其基因组的3’ LTR的增强子功能发生了缺失，从而形成了所谓的“自灭活”（Self-inactivation，SIN），即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产 生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此具有较好的安全性。病毒的包膜上嵌合了来自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多种细胞（包括分裂和非分裂细胞），且病毒更趋稳定。（Dull, T., Zufferey, R., et al., A Third-generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System, J. Virol., 1998, 72,8463-8471）慢病毒载体结构见图1。

HIV-1 genome

LVs vector
 

与HIV-1相比，慢病毒载体改造包括以下部分：
1、5’ LTR的U3区被RSV的enhancer/promoter取代，3’ LTR的U3区缺失；
2、HIV-1的全部9种蛋白，包括gag、pol、env等从载体基因组中缺失；
3、目的基因由CMV启动子控制，SV40启动子控制抗性基因BSD（Blasticidin）或报告基因EGFP。

包装容量
野生型HIV-1基因组的长度为10kb，本慢病毒载体的外源基因的插入总长度不能超过6kb（包括Blasticidin的表达盒及目的基因的表达盒），其中目的基因的长度不宜超过4.3kb，否则将影响病毒包装效率。

安全性

• 删除了全部HIV-1的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任何HIV-1蛋白的表达；
• 对5’和3’ LTR分别进行了删除改造，5’LTR缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR删除U3，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体；
• 病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分别独立放置在3个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；
• 与MuLV等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低；
• 慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，而MuLV等逆转录病毒载体有致瘤活性（Eugenio Montini, Daniela Cesana, et al., Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration, Nature Biotechnology, 2006, 24:687-696）；
• 慢病毒的LTR的转录激活能力低于逆转录病毒，激活原癌基因能力也相对较低；
• 全世界有4千万人感染了HIV-1，发生的整合事件不计其数，但未出现一起致瘤事件；

实验室安全措施
慢病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型慢病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！
所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶 胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有 接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用 0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛慢病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶，不要使用培养板来感染 病毒，以防意外洒落。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示。

生产流程

• 含目的基因的载体质粒pLenti-gene的构建和纯化提取；
• pLenti-gene、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞；
• 培养48~72h，收集培养上清；
• 病毒载体的纯化和浓缩（超离和/或超滤）；
• 分装、-80℃保存；
• 滴度测定、目的基因检定；
• 出具检测报告；
• 干冰运输发货

保存、使用和运输
慢病毒载体在-80℃保存6个月，滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融。
使用前从-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其尽快溶解。用不完的病毒可以暂时放在4℃冰箱中，但最好尽快用完，根据我们的经验，4℃放置1周，滴度会有4~5倍的下降。
对于长距离运输，应先将慢病毒载体保存在-80℃，再采用全程干冰运输，以防滴度下降。

质量控制
本元正阳对病毒载体的生产一贯采用全程监控的方式，以确保产品质量。您得到慢病毒产品的同时，将同时获得以下质量指标：

• 载体质粒构建检测
• 产品无菌检测
• 滴度检测
  物理滴度：p24 ELISA法/或RNA qRT-PCR法
  活性滴度：感染293后，GFP荧光FACS计数法/或qPCR法
• 目的基因的PCR检测

感染和分析
瞬时表达和稳定表达
瞬时表达：本产品感染细胞后，至少要培养24~48小时才能检测目的基因的表达。原因是慢病毒载体的基因组是RNA，需要反转录为DNA，并插入细胞染色体后产能表达。
稳定表达：本产品携带了Blasticidin（一种抗生素基因）的基因，如果用Blasticidin药物进行加压筛选，10~12天后可获得稳定表达目的蛋白的细胞克隆。

感染细胞最佳MOI的测定
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建 议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒，比如Lenti- EGFP）。

感染方法

• 按实验需要将细胞铺板（比如24孔板）。细胞数以第2天密度约50%为宜。37℃ 培养过夜。
• 感染前，从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，用新鲜完全培养基稀释成所需浓度。注意：轻轻混匀，不要使用振荡器。
• 吸去细胞原有培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中。
• 加入Polybrene（对于293细胞，终浓度6mg/ml，其它细胞可以按注1的方法确定合适的浓度），轻轻摇匀。37℃培养过夜。
• 感染后第二天，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。（或感染6小时后换液）
• 感染后第三天，根据需要，或收集细胞检测目的蛋白的表达，或换上含适当浓度的Blasticidin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株。
• 每3~4天换含Blasticidin的完全培养液一次。
• 换上Blasticidin后10~12天，抗Blasticidin的细胞克隆将形成。
• 挑选至少5个克隆，进行细胞扩增后，检测目的蛋白的表达。

Blasticidin的浓度筛选方法
一般情况下，2~10mg/ml的Blasticidin足以杀死大部分类型的哺乳动物细胞株。建议用0、2、4、6、8、10mg/ml的 Blasticidin培养待测试细胞，每3~4天换液一次，选择10天内杀死所有细胞的最低Blasticidin浓度作为工作浓度。针对293细胞， 我们推荐Blasticidin终浓度为6 mg/ml。

注：

• Polybrene:（Sigma公司产品，Cat. No. H9268）是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率。Polybrene有一定的细胞毒性，不同细胞对 polybrene的敏感度不同，可以用1~10mg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳。如果无法找到无细胞毒性的合适浓 度，可以不加。通常加入polybrene能提高感染效率2~10倍。配制方法：用无菌去离子水溶解Polybrene，浓度为6mg/ml。过滤除菌， 分装成1ml/支。保存在-20℃（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。4℃可保存2周。
• Blasticidin（Merk Index：12：1350，分子量458.9，分子式：C17H26N8O5- HCl）（10mg/ml储存液）：用无菌去离子水溶解BSD，浓度为5~10mg/ml。过滤除菌，分装成一次用量，保存在-20℃（可保存6~8 周），4℃可保存1周。避免反复冻融，不要保存在无霜冰箱中。培养液中的BSD在4℃可保存2周。另外，pH高于7.0会使BSD失活。
• 常用慢病毒滴度检测方法比较
   

名称	原理	单位	特点	优缺点	与GFP荧光法相比
p24核心蛋白定量法	ELISA Kit 1	ng p24/ml LP/ml TU/ml（估计）	物理（颗粒）滴度	经典方法，简单、重复性好	高估102~103倍 3
RNA基因组定量法	RT-qPCR	RNA/ml、 Vg/ml TU/ml（估计）	物理（核酸）滴度	精度高，但对仪器和操作要求高	高估102~104倍 2
GFP荧光计数法4	FACS（流式细胞计数）	TU/ml	感染滴度	经典方法，简单、重复性