荧光染料定义:能发出荧光的染料。在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反
射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。应用：由于大多数荧光染料不具备选择性，被固载在生物活性
载体的荧光染料，可利用生物活性物质之间的选择性，达到选择性识别变异细胞并定位的目的．如将染料与抗体或某些蛋白质载体相结合用于肿瘤的
检测，可用于许多抗癌药物中。第一节荧光染料的研究进展1.二十世纪是生命科学飞速发展的时期，从DNA双螺旋结构的发
现到现在人类基因组计划的完成，以及已经启动的后基因组计划――蛋白质工程；人类正从分子水平认识生命，阐述人的生老病死。2.生命科学
的发展就是人们对组成生物体的各种物质(如蛋白质，DNA，糖，及微量的金属离子，阴离子，中性分子等)进行不断深入研究和了解的过程，在
这个过程当中对某种物质的检测是研究的根本，要达到识别和检测这些物质的目的就需要有一种能够被检测到的信号来反映这些物质的浓度和所处的
状态。荧光化合物能够发出光信号，而且对生物体无损伤，是完成这一任务的理想选择，所以荧光化合物的研究一直是人们关注的焦点，它伴随着生
命科学的发展发挥着越来越重要的作用。3.荧光检测法不会对生物体产生辐射，且信噪比高，灵敏度好，是现在研究和应用最多的一种方法。随
着荧光分析检测技术的发展，荧光染料在在DNA杂交测试、免疫检测、基因重组检测、肿瘤细胞早期诊断和生物体内各种自由基以及各种生物活性
离子的分析检测等方面的广泛应用,极大地促进了荧光染料的发展。仅过去几年间就有大量文献和专利对这类功能性染料的研究及应用进行了报道。
第二节常用荧光染料大多数生物分子本身没有荧光或荧光较弱,检测灵敏度较低,为使之高灵敏地检出,人们常用强荧
光(Fluorescent)的标记试剂或荧光生成(Fluoregenic)试剂与待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价
或非共价结合的物质,使检出限大大降低。目前用于标记或衍生的荧光试剂主要有花菁类、BODIPY类、荧光素类、罗丹明类以及邻苯二甲醛
(OPA)类和香豆素类等化合物,它们本身或衍生产物具有很高的荧光量子产率,但最大吸收波长和荧光发射波长多小于650nm。
对生物样品而言,其样品基体和一些杂质在此区域也会有吸收或荧光再加上光散射的影响往往会产生较为严重的背景干扰,限制了荧光分析法灵
敏度的提高。相对于常规荧光(λem<650nm)检测而言,在近红外荧光(λem>650nm)光区,生物样品基体光吸收
或荧光强度很小,因而背景干扰大大降低,并且由于散射光强度与波长的四次方成反比,随波长的增加,拉曼散射迅速减小,使散射干扰也大为
减少。方酸菁染料及应用方酸菁染料是由方酸或其酯与富电子基团发生缩合反应而得1,3二取代衍生物,
取代衍生物通常是吡咯、吲哚、苯胺等基团。方酸菁上存在的方酸环残基使其最大吸收波长和发射波长向长波方向移动,并可增加其富电子性
,稳定方酸菁结构。对称性方酸菁的代表性结构如下:1.性质此类染料的结构比较稳定，在不同的试剂中,方酸菁染料的发射光谱
的位移并不明显,同时溶剂对方酸菁染料的荧光量子产率影响较为明显。随着溶剂极性的增大,染料的吸收光谱发生蓝移,表现为负向溶
剂化效应,在极性溶剂中的荧光量子产率比在水中的大。取代衍生物通常是吡咯、吲哚、苯胺等基团，可以被合成为近红外探针。2.
应用方酸菁染料对牛血清蛋白(BSA)有很高的亲和性。Ozinskas等报道了一种方酸菁衍生物和BSA结合后,荧光寿
命为自由状态的31倍、荧光强度为28倍,量子产率也有较大的提高。许多荧光探针与蛋白质结合后,当染料/蛋白质超过一定比率
时,量子产率会降低,这是因为浓度高导致荧光猝灭的缘故,其机制有待进一步探讨。TerpetschingE,
SzmacinskiH,OzinskasAandlakowiczR.
Anal.Biochem.[J],1994,217:197花菁类染料及其应用这类染料目前应用最为
广泛,此类探针中间为多次亚甲基桥,两端为噻唑、苯并噻唑和噁唑等,可在中间或两端修饰上多种基团,以获得优良性质，这些染料代表性结
构如下：1.优缺点优点：花菁类荧光染料的最大吸收波长大都在600～800nm之间,有的甚至超过80
0nm,在制得探针用于生物样品的测定时可以有效避免生物体内自发荧光和散射光的干扰，极大的提高检测的灵敏
度。缺点：花菁类荧光染料Stokes位移不大,一般只有20-30nm左右，摩尔吸光系数一般都有105L
·mol-1·cm-1,在水溶液中量子产率很低,与被分析物结合后吸收波长和发射波长发生变化，荧光寿命也增
加。2.应用花菁染料在DNA序列分析中有较多的应用,Chen等人合成了含有N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类花
菁染料用于标记寡聚核苷酸M13引物用作DNA序列分析,使用CE(毛细管电泳)分离,LIF(激光诱导荧光)检测,检出限为10-
10mol/L，且可用作DNA杂交探针。Shealy等人将IR-144经过修饰后,最大吸收波长可发生红移,用作DNA序列分析,
每次可以分析样品中大约500个碱基对,能够检测到0.1-1.0fmol的DNA片段。Lee等人研究发现单甲川花菁染料即噻唑橙(
TO)可作为非共价DNA及RNA测定的一类重要的荧光探针。Drexhage研究小组设计合成出一系列阳离子型噻唑橙类单甲川花菁染
料，实验表明这类染料与DNA或RNA作用时都有明显的荧光增强，因此都可应用于DNA分子的检测。花菁类探针也可共
价或非共价地标记蛋白质。许金钩等人采用花菁染料分光光度法测定血清蛋白质，其检测限为50ng／mL。IR-l25在血浆分析中有应
用，用光吸收法测定时检出限为125ng／mL，用LIF贝JJ为O.8ng／mL。Li等人利用新型水溶性近红外花菁染料DTCY与蛋
白结合后吸收光谱的变化研究其与蛋白质间的相互作用。Panova等人研究了新型的阴离子花菁染料与蛋白之间强烈的非共价结合作用，并
对细胞外蛋白及胶原质进行非共价标记后，利用其标记前后吸收光谱的变化研究了人体器官内蛋白的功能。该方法有望用于某些疾病的诊断。
研究发现，花菁既可以以单体，也可以以二聚体与核酸作用；花菁与核酸结合所形成的聚集体在结构上不同于染料在没有核酸存在下形成的
聚集。Rye等研究发现噻唑橙二聚体TOTO(两个TO发射团通过双阳离子连接臂连接)能同核酸形成稳定性更高的荧光络合物，而TO与
核酸的作用是可逆的。联二花菁类染料(jtlITOTO和YOYO)较之花菁单体具有更强的聚集倾向，因此正逐步成为核酸分析领域中一
类非常重要的荧光染料。激发和发射分别在794和810nm本课题组选择乙基花菁作为荧光团，羟肟酸作为铜离
子的选择性配体，设计合成了一种新型近红外荧光探针。最大激发波长位于712nm，最大发射波长位于745nm
BODIPY类荧光染料及其应用BODIPY类荧光染料的基本结构单元有a和b两种，即我们通常所说的BODIPY和唑系BO
DIPY。1.优缺点(1)由于BODIPY染料母体结构周围一般不直接连接对酸碱较敏感的氨基，羟基等，所以BODIPY染料一
般对pH值不敏感。(2)BODIPY染料的荧光量子产率一般都比较高，有的在水中的荧光量子产率可以达到接近1.0的水平。(3)
具有相对较好的光稳定性，比荧光素、花菁等稳定。(4)BODIPY类荧光染料的荧光光谱半峰宽较窄，作为荧光标识的时候有很好的灵敏
度。(5)BODIPY类荧光染料的摩尔吸光系数很大，吸光效率比较高。总结：具有较窄的吸收和发射峰、较高的摩尔吸光系数、较高的光
稳定性和化学稳定性以及较高的量子产率等。2.应用该类染料被广泛的应用于各种金属离子的检测，检测自由基，测定pH值，进
行DNA标记及测序等。BODIPY荧光染料进行特定修饰后，实现在紫外可见区以及红外近红外光区任意改变其吸收和发射波长，合成出各
种不同的染料可以广泛的应用到分析化学、生物化学、医学、临床诊断、环境科学等领域中，应用前景非常广阔。在母体染料上引入了
吡啶基团，并在两侧引入了噻吩基团，以使其发射波长红移至近红外区。染料在不同溶剂中染料的吸收峰位置、发射蜂位置、摩尔吸光系数、
Stocks位移、荧光量子产率如下表所示：具有活性基团短波长和长波长BODIPY由上图可知染料a的最大激发和发射波长分别为
560nm和608nm，Stocks位移为48nm，并且染料a的发射峰都比较尖锐、宽带比较窄，这些都是特征的BODIPY类化合
物的光谱，这是典型的该类化合物的特征。在染料b中由于具有较强的吸电子能力的Br的引入，使染料b的荧光谱图略微有些变化，主
要表现为染料的最大激发和发射峰的位置稍微发生红移，分别达到为571nm和617nm，Stocks位移为46nm，同时激发峰变宽
。最大激发和发射峰位置红移，同时染料仍然保持了发射峰半峰宽较窄的优点，这些都更加有利于染料进一步制成荧光探针用于分析检测。
在染料10中由氮原子代替了碳原子，由于氮原子中有一孤对电子，使π–π跃迁变为n-π跃迁，跃迁过程中的能级降低，使染料的激
发和发射波长有了较大红移。染料10的激发和发射波长分别达到了698nm和728nm，Stocks位移为30nm，发射峰半峰宽
较窄。染料10的激发和发射峰都在近红外区域，染料10制成生物探针之后，更有利于避开生物体内自发荧光的背景干扰用于生物体内物质的
检测。荧光素类荧光染料及其应用生物发光现象普遍存于自然界中，荧光素在生物发光现象中起着非常重要的作用。荧光素
，又称荧光黄，荧光红。荧光素分子存在着两种共振体，即内酯型和醌型，如下图所示。由于氧桥键把两个苯环固定在一个平面上，使分子具有
刚性共平面结构，有利于荧光的产生。1.特点荧光素及其衍生物是重要的荧光探针材料，属于咕吨染料。1871年B
aye首次合成出荧光素。荧光素的荧光发射光谱和pH值有关。当荧光素以阳离子形式存在时，其荧光量子产率为0.9-1.0；
当荧光素以中性分子形式存在时，其荧光量子产率为0.20-0.25；当荧光素以阴离子形式存在时，其荧光荧光量子产率为0.25－0
.30。中性分子和阴离子形式存在的荧光在515nm处都有最大发射，发射光谱一直延伸到大约700nm。当pH值为3时，相对荧光强
度为0,pH值在4和5之间增加缓慢，pH在6和7之间增加迅速，当pH值为8时，相对荧光强度达到最大值，当pH值大于8时，相对荧光
强度保持稳定。当酸度过大时，以硫酸为例，当硫酸浓度从1mol/L逐步增加到18mol/L时，荧光素的荧光寿命反而增加，并发生蓝
移。同样异硫氰酸荧光素的荧光强度也会随着pH值的变化而变化，据此发展了一种pH传感器。质添加到荧光素溶液中时，只会轻微地减小荧
光寿命。荧光素的寿命与荧光素的浓度、pH值和添加物的浓度有关。由于自吸和能量转移，荧光素的寿命随着荧光素的浓度增加而增
大。而浓度越大，荧光光谱的最大发射波长也越大，当荧光浓度增大至10-4mol/L时，荧光素的最大波长为522nm。当浓度低
于2×10-5mol/L，荧光素的自吸收可以忽略不计。当pH值增加时，荧光的寿命也增加。在pH>7时，荧光素的寿命基本保持
不变，约为4.65ns。有其它物质添加到荧光素溶液中时，只会轻微地减小荧光寿命。2.应用荧光素可以用在生物疾
病检测中。荧光素可以用来标记DNA。荧光素的N,N-二羧甲基氨甲基的衍生物可用来检测生物样品中的碱土金属、铝离子、钴离子、铜离
子、镍离子和锌离子。荧光素也可对阴离子进行检测。龚波林（龚波林，龚国权，王怀公.分析化学1997,25,906.）等报道了
荧光素荧光淬灭法测定微量的碘酸根。在0.05mol/LH2S04介质中，碘离子和碘酸根离子反应生成了碘，碘与荧光素反应，使荧
光素荧光淬灭。该体系的激发波长和发射波长分别为493nm和514nm。碘酸根含量在2-80μg/L范围内有良好的线性关系，检出限
为2.0μg/L。荧光素对苯氧羧酸杀虫剂进行衍生化，衍生化的产物用电动色谱进行分离，然后激光诱导荧光进行检测。这种方法经
过改进，不仅可检测苯氧羧酸，还可检测荧光素衍生化的其他物质。异硫氰酸荧光素一种荧光试剂，发射绿色荧
光，该分子中含有活泼的异硫氰酸基团。易溶于水和酒精溶剂，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530n
m，呈现明亮的黄绿色荧光。是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。可以用
于对抗生物素蛋白和生物素的检测。在318nm和494nm处对探针进行激发，它们的最大发射波长分别位于436nm和5
19nm处。罗丹明类荧光染料及其应用罗丹明衍生物和荧光素属于同一类的化合物，常见的罗丹明衍生物
由罗丹明6G、罗丹明B、异硫氰酸罗丹明、罗丹明G、高氯酸罗丹明6G、罗丹明101等。罗丹明类化合物是以氧杂蒽为母体的碱性染。其基
本的结构如下：1.优缺点与其它常用的荧光染料相比，罗丹明类荧光染料具有光稳定性好、对pH不敏感、较宽的波长范围和
较高的荧光量子产率等优点，因此被广泛应用在药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、分子遗传学、环境化学、单个分子检测、信息科学
、荧光标记、激光染料等方面，是分析化学和生物医药科学等生物技术领域中最常用的荧光染料之一。2.荧光量子产率荧光量子产
率是衡量荧光物质荧光量的尺度，有分析应用价值的荧光化合物其值常处于0.1-1.0之间。荧光量子产率指荧光物质吸光后所发射的荧光
的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值，可通过测量待测荧光物质和已知量子产率的参比荧光物质两者的稀溶液在同样激发条件下积分荧光
强度(即校正荧光光谱所包括的面积)和在该激发波长的吸光度加以计算得到。罗丹明B和罗丹明101可作荧光量子产率的参考物质。在所有
温度下罗丹明101的荧光量子产率几乎为1.0，因为罗丹明101具有较稳定的刚性结构。经过校正，在温度低于200K时，罗丹明B
的荧光量子产率几乎为1.0，但在室温下，罗丹明B的荧光量子产率小于或等于0.5。Kubin等研究了在0.5mol/L的硫酸介质
中罗丹明类化合物的荧光量子产率。具体的结果为罗丹明6G(0.95),罗丹明B(0.65),罗丹明3B(0.45),罗
丹明19(0.95)，罗丹明101(0.96),罗丹明110(0.92),罗丹明123(0.90)。3.发展
近年报道的新型罗丹明类荧光染料，主要是通过增加分子共平面性、结构刚性以及分子二电子共扼体系来提高荧光效率并使荧光红移。
在芳环上引入取代基以改变荧光的光量子产率和发射波长，这些结构上的修饰弥补了罗丹明的某些功能缺陷，使其具有了更高灵敏度、更高选择
性和可靠性，更加有利于分析检测。随着合成及应用技术的不断进步，研制高荧光量子产率、结构高度刚化、高稳定性和超高灵敏度的复杂杂环
罗丹明类荧光染料仍然是该领域的重要研究方向。噻嗪类和噁嗪类荧光染料及其应用噻嗪类和噁嗪类近红外荧光探针具有合成比
较容易、分子较小等优点,但其不足之处在于它们的荧光量子产率偏低,限制了其应用。常用的噻嗪类和噁嗪类近红外荧光探针的结构如下
:亚甲基蓝、噁嗪750可用作间接荧光测定芳香类化合物,噁嗪750可与人血清蛋白相结合,测定人血清蛋白其检出限可达0.
13pmol。耐尔红可非共价地标记蛋白质,检出限可达到0.1ng/mL(S/R=3)；也可作为荧光探针检测水溶液中DDT
型杀虫剂,适用于μg/mL的范围,选择性较好。酞菁类荧光染料及其应用酞菁环组成二维的共轭π－电子体系,
在此体系中,18个π－电子分别于内环C－N位。在红光区,酞菁具有强烈的吸收；其固态颜色依据中心原子,晶型,颗粒大小不同,可在
深蓝色到金属铜和绿色之间变化。由于酞菁是由VanderWaals构成的分子,存在各种各样的堆积方式；Iwatsu认为酞菁分子
堆积是柱状平面结构,在一个酞菁柱内,其作用力主要来自第一临近位。由于酞菁化合物的热稳定性(在空气中加热到400—500℃不
发生明显分解),加上酞菁化合物种类的多样性和其表现出的优异性能,使得酞菁的基础和应用研究得以广泛的进行。目前常用的酞菁类荧光染
料试剂的基本结构如下:目前常用的酞菁类荧光染料试剂的基本结构如下:此类探针有一尖锐的Q-2band在780nm
左右,正好和二极管激光器相匹配,且Q-2band和另一强吸收谱带(约在340nm处)相隔较远,重叠小,其Stokes位移
很小(10nm),散射光的干扰可使荧光光谱扩宽。在上图所示酞菁结构中,R1=HSO3-时,Cd2+可使最大吸收波长蓝
移至755nm,Mg2+可使荧光信号减弱,但发射波长无蓝移,Ba2+和Ca2+有类似的结果,且这类染料的荧光稳定性良好。
第三节趋势展望对于生物活性物质来说,检出灵敏度极限是单个分子。目前,人们已成功地
检测到单个荧光探针分子。目前现有的近红外荧光探针有其突出的优点,但同时也存在不足,如染料种类不多,合成困难,染料的光、
热、化学性质不太稳定等。近红外探针分子共轭体系大,分子易扭曲变形,引起分子共平面性的改变,对荧光性质有不利影响。将现有某些
荧光试剂的荧光量子产率提高与近红外荧光染料的长波长发射即低背景干扰结合,是新设计的近红外染料荧光探针合成的主要方向。另外要求
新合成的荧光染料的发射波长与激光光源相匹配,以获得最大荧光强度。谢谢大家！theemissionpeakfrom573to585nm在不同溶剂中染料的吸收峰位置、发射峰位置、摩尔吸光系数、Stocks位移、如下表所示：2324242424252323Stocks位移(nm)689682681680676677676675发射峰(nm)1860017200168001660016400174001680017000摩尔吸光系数（M－1cm－1）665658657656652652653652吸收峰（nm）二甲基亚砜四氢呋喃三氯甲烷二氯甲烷乙腈乙酸乙酯乙醇甲醇溶剂染料化合物在不同溶剂中的荧光量子产率和荧光寿命如下图所示：2.071.802.282.021.781.891.901.65荧光寿命（ns）0.300.310.430.340.280.320.500.48荧光量子产率二甲基亚砜四氢呋喃三氯甲烷二氯甲烷乙腈乙酸乙酯乙醇甲醇溶剂 |
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