摘要：以铁皮石斛茎节段为外植体，研究不同浓度的外源激素配比对铁皮石斛诱导和增殖的影响。实验表明，不定芽诱导最佳诱导培养基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，最佳增殖培养基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+10%椰子汁。
关键词:铁皮石斛;不空等;诱导;增值
铁皮石斛（Dendrobium officinale）又名黑节草，属气生兰科草本植物。其所含主要成分石斛多糖和石斛碱，具有滋阴、益胃、生津止渴、润肺止咳、强壮及增强免疫活性的作用[4]，为南亚和东南亚地区著名的中草药[5]。在我国主要分布于江西、广西、广东、贵州、云南、安徽、浙江、湖南、陕西、河南、福建等地[1-3]，多分布于海拔近千米的山地半阴湿岩石上，一般均能耐-5℃的低温[4]。在野生状态下，铁皮石斛繁殖速率低下、生长缓慢，加之掠夺性采挖，使其野生资源日益减少，远远不能满足国内外市场经济发展和临床医学的需要，因此铁皮石斛人工种植的规模迅速扩大[6-7]。常规条件下，铁皮石斛人工繁殖较困难，组织培养技术在铁皮石斛生产中得到广泛应用。本实验以铁皮石斛茎段为外植体，并直接从茎段诱导丛生芽增殖，获得大量的试管苗，建立了铁皮石斛的快速繁殖体系，缩短了铁皮石斛无性繁殖的周期，为进一步加快铁皮石斛组织培养产业化发展奠定了技术基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
供试材料铁皮石斛外植体采自宁波市鹿亭乡白鹿村。
1.2 外植体的消毒与培养
从铁皮石斛植株上选择新生健壮的茎段作为外植体，摘去叶片和膜质叶鞘，剪取2cm长带茎节的小段，用洗洁剂小心清洗后，置流水下冲洗10min备用。在超净工作台上用无菌水浸泡5min，75％的酒精消毒5s，0.1％HgCl灭菌5min后，再用无菌水冲洗数次，放入垫有干无菌滤纸的培养皿中，以吸去多余水分。在茎段两端各切去少许，保留茎节接入准备好的诱导培养基中，每瓶培养基插入10个茎节小段。经一段时间的诱导，外植体膨大并产生原球茎，将诱导形成的原球茎转移到增殖培养基中培养。选择基本培养基均为1/2MS+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH 5.7～5.8。培养条件：温度21~23℃，光强为2000Lx，光照时间12h/d。
1.3不定芽的诱导
以不同配比的激素：6-BA，萘乙酸（NAA），筛选出适合不定芽诱导的激素种类。茎段经过消毒后，接种在诱导培养基中，每个处理20株，每3天观察不定芽的诱导情况，比较诱导率与诱导时间，筛选出最适合的诱导培养基。
1.4不定芽的增殖
添加6-BA、NAA、椰子汁，选取大小一致的不定芽进行增殖培养，每3d观察增殖情况。
2 试验结果
2.1不定芽的诱导
本试验将铁皮石斛茎段外植体接种于1/2MS培养基附加不同浓度6-BA和NAA的培养基上，进行初代培养。外植体培养30d后的诱导结果见表1。结果表明，高浓度的NAA会抑制腋芽的萌发；6-BA在试验中对腋芽诱导的作用表现为：随着NAA浓度的增加，6-BA作用明显；综合考虑芽诱导率和健壮度等因素，处理8（1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）最适合腋芽诱导，此时腋芽的诱导率最高，芽健壮度也较好。
表1 不定芽的诱导
|
编号 |
6-BA
（mg/L） |
NAA
（mg/L） |
诱导倍数 |
诱导生长情况 |
|
0 |
0 |
0 |
1.0 |
正常 |
|
1 |
0.5 |
0.1 |
1.4 |
正常，愈伤组织少 |
|
2 |
0.5 |
0.2 |
1.2 |
正常，愈伤组织少 |
|
3 |
0.5 |
0.5 |
1.1 |
芽少，深绿色，有根 |
|
4 |
1.0 |
0.1 |
2.1 |
正常， |
|
5 |
1.0 |
0.2 |
1.5 |
正常，芽饱满，少量根 |
|
6 |
1.0 |
0.5 |
1.2 |
正常，有根 |
|
7 |
1.5 |
0.1 |
4.8 |
芽分化较多，芽细弱 |
|
8 |
1.5 |
0.2 |
3.8 |
正常，芽健康 |
|
9 |
1.5 |
0.5 |
2.3 |
正常，有根 |
|
10 |
2.0 |
0.1 |
6.2 |
不定芽畸形 |
|
11 |
2.0 |
0.2 |
4.3 |
不定芽畸形 |
|
12 |
2.0 |
0.5 |
2.9 |
不定芽玻璃化，畸形多 |
2.2不定芽的增殖
将诱导培养中大小一致的不定芽转接至含不同浓度的6-BA和NAA的培养基中，浓度梯度同诱导试验处理梯度。培养30d后，结果表现为，降低NAA与6-BA浓度，在处理5（1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）的浓度配比下，增殖倍数为3.3，综合观察下不定芽生长状况最好，并在后续的继代培养中保持增殖倍数3倍以上。在增殖培养基上添加10%的椰子汁，铁皮石斛增殖苗增值率有所提高，增殖倍数达4倍左右（表2）。
表2 不定芽的增殖
|
编号 |
6-BA
（mg/L） |
NAA
（mg/L） |
增殖倍数 |
生长情况 |
|
1 |
0.5 |
0.1 |
2.0 |
正常 |
|
2 |
0.5 |
0.2 |
1.5 |
正常 |
|
3 |
0.5 |
0.5 |
1.4 |
芽少，有根 |
|
4 |
1.0 |
0.1 |
3.3 |
正常 |
|
5 |
1.0 |
0.2 |
3.3 |
正常，芽饱满 |
|
6 |
1.0 |
0.5 |
1.9 |
正常，有少量根 |
|
7 |
1.5 |
0.1 |
4.9 |
芽多，偏小 |
|
8 |
1.5 |
0.2 |
3.5 |
正常，芽多，成长缓慢 |
|
9 |
1.5 |
0.5 |
3.3 |
正常，有根 |
|
10 |
2.0 |
0.1 |
6.9 |
不定芽畸形 |
|
11 |
2.0 |
0.2 |
5.3 |
不定芽畸形 |
|
12 |
2.0 |
0.5 |
5.0 |
不定芽畸形 |
3 讨论
本研究表明，在不定芽诱导试验中，NAA在与6-BA搭配使用下，表现为低浓度的NAA促进铁皮石斛腋芽萌发，诱导芽的分化；过高浓度NAA则会抑制腋芽的萌发，这与郭洪波[8]的研究结论相同。张治国等[9-10]研究了铁皮石斛原球茎在VW、N6、1/2MS、B5、KC等6种培养基上的增殖和分化情况，结果表明，附加马铃薯提取液和植物激素后的6种基本培养基，原球茎均可分化，其中1/2MS是原球茎增殖和分化的最适宜培养基。我们的研究结果也与张治国等的研究结果一致：不定芽诱导的最佳诱导培养基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，最佳增殖培养基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+10%椰子汁。本试验以茎段为外植体，具有易取材，繁殖系数高，繁殖速度快，周期短等优点，在没有种子的情况下利用茎段外植体同样能快速生产铁皮石斛植株。
参考文献：
[1] 谢宗万．中药材品种论述（中册][M]．上海：上海科学技术出版社．1984：419．
[2] 江苏新医学院．中药大辞典（上册）[M]．上海：上海科学技术出版社．1986：586．
[3] 查学强，魏鹏，罗建平．8种产地铁皮石斛蛋白质和同工酶分析[J]．安徽农业科学，2007，35(27)：8464-8465，8473．
[4] Wu H S，Xu J H，Chen L Z，et a1．Studies on anti—hyperglycemic effect and its mechanism of Dendrobiumcandidum [J]．China Journal of Chinese Materia Medica，2004，29：160-163．
[5] Zhao Wang W，Sheng F F，et a1．High—frequency shoot regeneration through transverse thin cell layer culture in Dendrobium candidum Wal1．ex Lindl[J]．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2007，90：131-139．
[6] 金银兵．铁皮石斛的生物学特性与开花授粉技术研究[J]．安徽农业科学，2009，37（11）：5280-5282．
[7] 高晓余，赵艳，朱吉胜，等．石斛篓象的生物学特性[J]．昆虫知识，2010，47(1)：46-49．
[8] 郭洪波，于晓丹，陈丽静，等．铁皮石斛茎节离体培养的研究[J]．时珍国医国药，2007，18（11）：2659-2660．
[9] 张治国，刘骅，王黎，等．铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究[J]．中草药，1992，23（8）：431-433．
[10] 张治国，王黎，刘骅，等．铁皮石斛原球茎分化适宜培养基研究[J]．中国中药杂志，1993，l8（1）：16-19．
[11]陈薇，寸守铣．铁皮石斛茎段离体繁殖[J]．植物生理学通讯，2002，38（2）：145．
