虎纹镇痛肽的特殊毒理学

悬壶佳 2012-12-01

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广西聪宝保健食品有限公司生物化学实验室

实验报告书

委托单位: 公司蛋白质化学与分子生物学研究室送检日期: 2003.8.28

样品名称: 虎纹镇痛肽（冻干粉）产品批号: 00020182

鉴定项目: 虎纹镇痛肽的特殊毒理学样品包装: 玻璃瓶（200μg/瓶）

实验日期: 2003年8月30日至2004年1月18日

1. 受试样品来源

1．1 受试样品：虎纹镇痛肽（冻干粉）。广西聪宝保健食品有限公司采用电脉冲技术自行提取，分离纯化。批号000418, 200μg/瓶。纯度:供试的HWAP-I系由高减液相色谱分离的含量)96%的冻干粉剂。

1．2．溶剂与配制方法:本试验所用的HWAP-I纯粉剂均以培养基1640(GibcO公司，以注射用水配制)溶解。具体配制方法:RPMI-1640干粉一包，10%小牛血清100ml(56℃水浴灭活处理30min), GIn0.3g、HEPES3g、NaHCO3g,青霉素2×104u,链霉素1×1000000U 用900mL注射用水溶解后用5. 6%NaHCO3,调PH至7. 20-7. 40,最后用0. 2μm孔径微孔滤膜加压过滤即可。

赋形剂:(200μg HWAP-I加lmg甘露醇+1mg乳糖)/瓶。

溶剂的选择和理由:因CHL细胞的培养液为1640培养基，固用该培养基作溶剂。

秋水仙素:AR，购自上海药物研究所实验药厂。

1．3．对照品:

阳性对照:环磷酰胺，购自Sigma公司。

阴性对照:注射用水。

1．4．细胞:

中国仓鼠肺细胞(CHL):购自上海市疾病预防控制中心。

2. 致突变性的实验

2．1实验方法

哺乳动物培养细胞染色体畸变试验。

2．2实验依据

根据新药临床前研究指导原则的要求进行。

2．3 剂量设计:

在CHL细胞染色体畸变试验之前，以畸变试验中培养CHL细胞的同样条件，设置HWAP-I的一梯度浓度，测定出HWAP-I对CHL细胞的半数抑制浓度(IC50)为8.4 1mg/mL。以1/4 IC50(即2. 10mg/mL)为最大剂量，按等倍递减设置四个浓度。

2．4 代谢活化剂:

大鼠肝微粒体酶(S9)，由上海市疾病预防控制中心提供，以液氮保存。

2．5 药物作用时间:

药物和细胞接触非活化组分分别作用24h和48h收获细胞。代谢活化组分作用的时间相同。

2.6 标本制作时间:

直接法在加入HWAP-I后24h和48h分别收获细胞

间接法在加入HWAP一的同时加入S9混合液，继续培养24hr和48hr分别收获细胞。

2.7 实验操作

以2100ug/mL,1050ug/mL,525ug/mL,263ug/mL和0ug/mL浓度的HWAP-I，并以环磷酰胺(450u g/mL)做为阳性对照培养CHL细胞(1640培养基，Gibco公司产)。以5×105个/瓶细胞接种。在

有SRmix或无sRmix的条件下，分别加入不同浓度的HWAP-I与环磷酰胺，24h和48h小时后收获细胞。每个剂量组设两个细胞培养瓶。在收获细胞前两小时加入秋水仙素至浓度为0.4 ug /mL。以常规方法制片和Gimmsa染色(pH6.8 ) 。计数良好的中期分裂细胞，在油镜( 10× 100倍)下观察并记录染色体畸变类型和畸变数。按通常的标准判断：

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细胞畸变率<5% 阴性(一)

细胞畸变率>5% 可疑(士)

细胞畸变率)10% 阳性(+)

细胞畸变率>20% 阳性(++)

细胞畸变率>30% 阳性(+++)

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3. 结果

HWAP-I 对CHL细胞的染色体畸变作用的结果见下表

HWAP-I对中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)染色休畸变的作用

受试药物终浓度（μg/ml） S9 时间（h）断裂缺失碎片双着丝点其他 % 判断

263 - 24 3 3 -

263 + 24 0 0 -

525 - 24 2 1 3 -

525 + 24 1 1 -

1050 - 24 5 5 -

1050 + 24 1 1 -

2100 - 24 3 1 5 -

2100 + 24 4 4 -

HWAP-I 263 - 48 1 2 3 -

263 + 48 2 2 -

525 - 48 3 3 -

525 + 48 3 3 -

1050 - 48 1 1 -

1050 + 48 4 4 -

2100 - 48 5 5 -

2100 + 48 3 4 -

- 24 3 3 -

+ 24 3 4 -

H2O - 48 2 2 -

+ 48 3 3 -

450 - 24 22 1 2 24 ++

环磷酰胺 450 + 24 23 2 1 26 ++

450 - 48 25 1 26 ++

450 + 48 23 2 25 ++

4．结论

阴性对照组细胞畸变率均在4%以下，阳性对照组细胞畸变率均超过20%。在加与不加S9混合物时，HWAP- I各剂量组与阴性对照组比较，CHL细胞的染色体畸变数无显著性增加，也未见明显的剂量效应关系，统计学分析无显著性差异(P>0.05)，与阳性对照组比较则有非常显著性差异(P<0.0 1)，表明HWAP-I的染色体畸变试验为阴性。