抗原修复方法的合理选择——来自专家的详细解释

抗原修复方法的合理选择来自专家的详细解释) 为什么要进行抗原修复？ 组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。  在免疫组化染色后的镜下观察中，有发现这样的结果，阳性物反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性，这是因为：  1.组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封闭抗原的决定族。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键8。这也是甲醛的一个作用，因为它是一种聚合固定剂，因而能在相邻的蛋白质键间形成桥键的作用。  2. 甲醛在保存进程中会形成羟甲基，也可封闭抗原决定族。据French和Edsall的研究认为，最常遇到的甲醇反应，就是加到一个含反应性氢原子的化合物中，形成一个羟甲基化合物。  3.在组织固定过程中，甲醛与蛋白质发生交联，形成醛交联蛋白，这种化合物封闭了抗原，使之无法表达出来。  为了解决上述存在的问题，更好地暴露出抗原，将其很好地显示出来，目前世界上公认的方法就是必须进行抗原修复。  抗原修复方法的正确选择 应用于临床病理的各类抗体已有三百多种，但总的来说可以根据其相应抗原在细胞中定位不同分为两大类，即胞核抗体和胞浆抗体。一般而言，对于胞核抗原，因为核膜的屏蔽作用，可使其抗原决定簇空间位阻加大，从而相对于胞浆抗原来说容易形成抗原封闭，故其修复难度要大得多。根据实际操作经验，临床应用的各类抗原修复法，其修复能力由高到低依次是:高温高压法>高温煮沸法>微波法>超声法>酶消化法。可以说，高温高压法是一个广谱抗原修复法。但从长期实验操作的经验来看，该方法对于神经系统相关抗原和丙肝抗原等修复不理想，如修复时间掌握不好还可造成假阳性（当然也有假阴性）。那么，是否每一种抗原都必须进行修复呢?答案是否定的。对于操作者而言，每购进一批新抗体都要进行对照实验，试剂说明书中标注的抗原修复法不是完全适应于每一个实验室的。只有经过自己反复对照后才能彻底掌握各种抗原的 最佳修复方法。事实上，绝大多数抗原是不需要作任何修复的（胞浆抗原为主，但是，对免疫组化的其它操作流程必须标准化，否则便难以达到满意的效果。总而言之，正确选择抗原修复法，可按如下流程进行。 首先，在对抗体不熟悉的情况下，可先不作任何修复，直接进行免疫组化的常规操作，然后与阳性片作对照，如能达到相似或相近的效果则说明无需进行修复，如出现阴性则可进入下一步;第二，对标本进行化学性修复操作，如仍为假阴性则可进入下一步;第三，物理/化学性修复，强烈推荐高温高压修复法。虽然该法较之微波法和超声波法麻烦，但效果明显，定位更准确，假阴性出现的几率最小。 一般而言，每个免疫组化实验室必须经过这一筛选过程方可掌握每一种试剂的最佳使用方法，并形成固定的操作方案，因各病理科对标本的先期处理方法差异较大，不可能千篇一律。而标本的抗原封闭主要是发生在固定阶段。但在标本固定这一问题上，经笔者多方调查发现，真正规范化的固定方法只在少数大医院得到了正确的应用，这也就是免疫组化抗原修复方法难以一概而论的根本原因所在。 此外，修复介质的正确选择也是十分关键的因素。柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）是最佳选择，不但成本低，且染色背景清晰，易于保存，还不易引起组织块脱落。但是，柠檬酸盐缓冲液也不是万能的，如CD3、nm23、P53等就很难达到理想的效果，必须使用EDTA液或Tris液。所以说，没有一种万能的修复法，也没有万能修复介质，这是每一位病理技术人员都应该正确认识到的一条准则。还有，也应该客观地分析抗原修复后的显色效果，因为抗原修复可以使部分抗原定位发生转移。如P185、BCL-2、nm23等原本应表达在胞浆的抗原经抗原修复后，大都出现在核内;与之相反，P53、PCNA、Ki-67等原本表达在核内的抗原可以转位于胞浆或胞膜。这些都有待我们进行更深一步的研究和探讨，使之更加完善，真正成为病理诊断的坚实后盾。