问题如下：
1. 免疫荧光好还是做免疫组化好？我倾向于做免疫组化，但老板倾向做荧光，我想两种方法都了解一下，能否介绍一下两种方法的详细步骤（protocol）。
2. 一抗、二抗抗体（包括荧光抗体）如何选择，哪个公司的比较好？浓度怎么掌握？
其实IHC和IFC本质都是一样的。只是最后的显色方法不一样，IHC是用酶加底物进行显色反应，用普通光镜观察；IFC是直接用带有荧光物质连接的二抗与一抗结合，在相应波长的激发光下观察。
我也倾向于IHC，理由如下：
IHC的级联放大作用使得抗原比较少的组织也能有很强的着色。我一般用Vector公司的Elite系列ABC kit，HRP－DAB显色系统。
IHC的切片可以长期保存。很多时候试验做出来了，需要反复的看片子。而IFC的有荧光猝灭，无法长久保存。所以不利于反复阅片。
IFC有利于做Multiple Labeling，比如在同一location的两种或多种抗原的比较，通常用IFC；IFC还多用于活细胞的staining，但如果是石蜡切片，总会有一些自发荧光现象存在。所以个人认为，能用IHC的时候建议不用IFC。
详细protocol请在本版内search一下，已经有很多的讨论了。
一抗通常买DAKO、SIGMA、VECTOR，二抗可以选择相应公司的，也可以买SANTA CRUZ的，比较便宜一些。荧光二抗建议买Molecular Probe的，现在和Invitrogen合并了。
浓度先参考data sheet上的，不过还是自己要optimize一下，比如建立个浓度梯度。阴性对照用相同种属来源动物的IgG。
供参考。
GOOD LUCK!
免疫荧光结果分析及抗体选择——许多问题你思考过吗？免疫荧光因其直观、色彩鲜明而被广泛用于检测各种蛋白的定位表达。
（1）免疫单标
此时与免疫组化的用途相近，仅能检测待测蛋白在细胞中的表达部位，如细胞核，细胞浆及细胞膜。
疑问：许多蛋白既在细胞核又在细胞浆表达，某蛋白活性发生变化后主要表现在该蛋白在细胞核与细胞浆存在表达量的差异（如NF-KB/ERK等）。因此某些实验的研究目的就是观察某种干预后这些蛋白是否存在活性的变化。针对这种细胞核和细胞浆均存在蛋白表达的蛋白质分子，单一的免疫荧光是否能说明问题，是否需要DAPI染色协助说明该蛋白的细胞定位？此时会出现多种可能，（1）两种染色不重合（不同细胞分别染色）；（2）两种染色重合但不叠加（同一细胞分别在细胞核DAPI染色和细胞浆待测蛋白染色）；（3）两种染色叠加（同一细胞同时在细胞核两种染色）；（4）两种染色重合且叠加（同一细胞细胞核DAPI染色及待测蛋白细胞核及细胞浆染色）。此时DAPI染色是否有这个必要。
（2）免疫双标
很多情况下，某一蛋白在同一样本同一组织不同的细胞系表达，如脑组织中的神经元和神经胶质。为了观察某一蛋白的表达变化，设计严谨的实验需要进行免疫荧光双标染色，除了明确蛋白的结构定位（细胞核、细胞浆及细胞膜）还要进行细胞定位。
疑问：如何选择细胞标记物，如神经元有NeuN(细胞核)、NSE（细胞浆）、MAP-2(胞浆及轴突)，但推测待测蛋白在神经元的细胞核表达，需要选择神经元的标记物为NeuN(细胞核)还是其他，结果如何分析。
以上疑问困惑很久，以前只知道盲目实验，论文写作过程中才发现出现很多问题，而且也经常被审稿老师追问，希望各位老师及战友分享自己的经验，大家共同提高！
（1）
我以为，IF能提供一种形态学上的translocation的趋势的证明，如很多beta-catenin的研究都会用到IF以证明其转入胞核中，而其中，我所见的绝大部分都没有用到DAPI。因为单染的效果很明显，空的圆圈肯定是胞核嘛。不染DAPI的效果已经足够好。即使染了，也不宜converge，因为DAPI会掩盖胞核的beta-catenin荧光信号，也只能平行放一张证明那个空圈是胞核，其实这样就意义不大了。我想这是很多人没有染/展示DAPI的原因。
当然，如果要进一步说明问题，还是分别提胞浆和胞核的蛋白，分别作WB以定量的好。TF的可以直接做EMSA。
（2）
“为了观察某一蛋白的表达变化，设计严谨的实验需要进行免疫荧光双标染色”用IF来说明蛋白的表达变化，实在是不靠谱，荧光强度的影响因素太多了。IF只是提供定位而已。
双标marker选择的话，核marker和胞浆marker其实都可以的。具体是看converge后，能否很好地标示出两种抗体都是染在同一个细胞上。如果用NeuN，没有胞浆形态，似乎不太好看，但是有没有double到就看得很明显。MAP-2的话，有时候染色效果不好，难以分辨出单个细胞，需要费点劲挑出典型的double的细胞。但如果染得好，效果就很漂亮了。当然，提供共聚焦的三维图片是更好了。但是，如果二维图片很典型的话，一般是认可的。
某些完全在胞浆表达的蛋白如果染色成功，的确能清晰看到空的圆圈（为未染色的完整的细胞核），如果加染DAPI仅仅是使胞浆和胞核重合，converge后看到一个完整的细胞，对分析意义不大。某些蛋白既可在胞浆又可在胞核，单染后同样可能在胞体中间发现不规则的空圈，此时主观的判断表达部位，容易被审稿老师提问，要求DAPI进行参考定位（这就是发帖判断这种要求是否科学的缘由）。
（2）双标marker选择的话，核marker和胞浆marker其实都可以的。具体是看converge后，能否很好地标示出两种抗体都是染在同一个细胞上。如果用NeuN，没有胞浆形态，似乎不太好看，但是有没有double到就看得很明显。MAP-2的话，有时候染色效果不好，难以分辨出单个细胞，需要费点劲挑出典型的double的细胞。但如果染得好，效果就很漂亮了。当然，提供共聚焦的三维图片是更好了。但是，如果二维图片很典型的话，一般是认可的。
至于选何种marker，一直不知道选择的标准，如果是根据converge后，能否观察两种抗体都在一个细胞上，我认为各种marker都是可以选择的。
（3）用IF来说明蛋白的表达变化，实在是不靠谱，荧光强度的影响因素太多了。IF只是提供定位而已。
完全赞同以上观点，我的理解免疫荧光实际只能回答有或无及在哪里。经常看到这样的文献探讨某一干预措施对X蛋白表达的影响。将研究对象分为正常组、模型组、不同剂量干预组，然后均采用免疫双标观察此蛋白在各组中的表达，这样的设计是否合理？（此处不讨论WB定量），有无必要？如何设计免疫荧光的检测？ |
免疫荧光抗体能用于免疫组化吗？因某公司只有用于免疫荧光的抗体，但我要做免疫组化。可以用吗？
|
免疫荧光和免疫组化使用的切片一般都不同，一个是冰冻切片，一个是石蜡切片，所以切片上面的目的蛋白的修饰程度都不一样，所以很多情况下是不能通用的。你想如果都能通用，哪个公司的抗体说明书上还区别IF和IHC啊，全都写上不是更好！所以选择抗体一定要在用途那一栏找到自己需要的具体用途。
santa的那种抗体，还是做个IF试试吧，不行最起码还可以投诉，没准还可以更换一支，做IHC做不出来根本没有投诉的可能。祝好运！ 原理其实是一样的，最好做冰冻切片 石蜡切片照样可以做免疫荧光的，只不过需要抗原修复，尽量不要用H2O2阻断（据军科院的老教授说会减弱荧光显色）
可以用于免疫荧光的抗体当然可以用于免疫组化，前面的原理都是一样的，只不过二抗一个选的是辣根酶标记的，一个是荧光素标记的，当然免疫组化跟免疫荧光所需的条件不同，需要重新摸索适当的浓度比例
如果免疫荧光做出来了，说明一抗可以和目的蛋白结合，二抗跟一抗结合也没问题，那么免疫组化做不出就可以怀疑是二抗问题了
当然还有一个极端情况，就是免疫荧光看到的就不是目的蛋白而是自发荧光，那么就是一抗问题了 1 上面的帖子让我学习了很多。我们实验室因为石蜡切片做的多，以石蜡切片为例。如果免疫组化能做出来，免疫荧光基本是能做出来的，因为原理基本一致，而免疫荧光比免疫组化要敏感。一般来说大公司的一抗写着可以做免疫组化，那基本都是能做的出来的，如果只是写着免疫荧光，没写免疫组化，你写信咨询一般得到的答案是，没有做过（石蜡切片）的免疫组化，不建议使用，其实是在推卸你万一做不出的责任。其实结果就是可能做的出，也有可能做不出。我们实验室的人做出来过只标着IF，没标IHC的，做出了IHC。
2 对panmo2006战友所说的自己深感兴趣，特的找了以metalcolin战友所说的santa cruz抗体为例，我以MCP-1抗体为例。现在去查santa cruz MCP-1抗体官网基本查不到可以做IHC，免疫荧光一般都是可以的（也不能排除我查找的资料不全，因为有些文献，特别是国内的文献抗体货号是不给出的，而且抗体的资料也都是在变化）。
《单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质MCP-1的表达及其意义》欧阳春，宁建平，周巧玲 - 中南大学学报:医学版, 2004；《MCP-1和VEGF在膀胱癌中表达的相关性及其意义》胡毅，关桂梅，孔祥波，董震 - 中国实验诊断学, 2006。在这2篇国内文献都是提到了santa cruz的MCP-1抗体做免疫组化。
另外一篇国外文献 J Reprod Immunol. 2003 Dec;60(2):143-57 《Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2) in experimental autoimmune orchitis》也是santa cruz MCP-1抗体做免疫组化。货号是SC-1785 ，在官网上可以查到是用于WB，IP，IF，SiRNA。但是他这里还是用用免疫组化，并有照片，在Page9 Fig4 图A-C。
小子愚见，敬请高手指教。
【求助】关于免疫荧光和免疫组化的优劣刚开始做免疫学的实验，有个问题想请教各位大侠啊！免疫组化（石蜡切片）和免疫荧光的优劣如何比较？我是想检测三种物质的表达水平改变，同时分析三者改变是否具有相关性，想做荧光，老板说最有一步如何定量测定？我也搞不清楚了。现在很急了，请各位指教啊！非常感谢!
定量可能要做WESTERN吧，做免疫荧光，免疫组化，都是只能大概的量，好像不能定量吧，这个是我的看法。不知道是否正确，请各位高手批评指正。
我的观点如下：
1、一般蛋白表达定量的方法最好用ELISA、RIA和Western blotting等，免疫组化和免疫荧光在定性和定位上很有优势，当然，你的片子做得很好（特异性染色强而非特异性染色浅），可以相对半定量蛋白表达，但拍照一定要在相同条件下（成像系统中的参数设置）。
2、免疫组织化学和免疫荧光的区别：
（1）原理方面：前者是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行测定的技术。而后者是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下直接观察；
（2）标本制作：免疫荧光一般用冰冻切片，最好用新鲜组织；而酶免疫组化用石蜡切片或冰冻切片均可以。
（3）实验方法：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程和抗原修复、脱蜡过程等。
（4）染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间内有效，时间长了荧光可能衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。
（5）实验条件：免疫荧光要求较高，实验室最好有荧光显微镜，激光共聚焦显微镜更好；而酶免疫组化要求较低，只需普通光学显微镜即可。
我的观点是:
1、免疫荧光一般用新鲜组织的冰冻切片，效果很好，但避免反复冻融组织，否则抗原弥散和祖先细胞结构破坏；而石蜡切片一般用免疫组化的方法较好。但有人说国外现在有些实验室也用石蜡切片做免疫组化，前提是有高质量的一抗和荧光素标记的二抗等优良条件。
2、如果做定位，且只要你的抗体可以做IHC/IF，那我认为可以用免疫组化的方法做缓激肽(Bradykinin)在爬行动物生殖腺中的定位。
3、最后，我觉得你要抉择免疫组化和免疫荧光？如果是胞膜蛋白，建议用冰冻切片做免疫荧光分析，前提是组织新鲜取材，否则抗原弥散严重；如果是胞浆或胞核蛋白，可以用石蜡切片的免疫组化方法，只要你的抗体能够做石蜡切片免疫组化和适当的微波修复，效果还是可以的。
4、石蜡切片的优势在于组织细胞结构保存完整，但对抗原的损伤较大，尤其醛基对抗原决定族的封闭作用；而冰冻切片对抗原的保真较好，但反复冻融的组织切片，组织细胞形态结构不完好，进而影响定位。
biancheng2007 wrote:
谢谢！因为我的实验样品都不是新鲜的，都是早已取好，保存在4度，70％酒精中的，所以只能做石蜡切片。关于抗体的问题，我很想知道如何选择抗体？买的抗体一般是能做免疫荧光的，但是我怕不能做出，因为买的基本都是来源于哺乳动物的，我想做的是爬行动物的！
1.抗体选择要求和原则：
1）选择单克隆还是多克隆抗体？前者特异性好，但灵敏度差；而后者灵敏度好，但特异性稍差。我喜欢选择多克隆抗体，供参考。
2）选择何种种属来源？这主要与你的二抗来源有关，若选择兔来源的，那二抗就是羊抗兔或鼠抗兔；一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。
3）更重要的是能检测何种种属的抗原，即species reactivity:Hu-human, Ms-mouse, Rat, Goat, Rb-rabbit, Shp-sheep等。
4）ISOTYPE：IgG1/IgG2a/IgM?一旦一抗选为IgM，那么你二抗就必须是抗IgM。
5)APPLICATION：WB, IP, IF, IHC(P), ELISA?一抗说明书中注明抗体可以应用于western blotting、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组化（石蜡切片）、ELISA等等，这根据你实验目的抉择。
2、你仔细看一下抗体说明中能检测什么种属的抗原，即species reactivity:Hu-human, Ms-mouse, Rat, Goat, Rb-rabbit, Shp-sheep等，再加选择。
免疫荧光和免疫组化哪种方法更好？我要检测细胞表面TLR2的表达，我买的抗体说明书上介绍该抗体用于免疫荧光和Western blot，不过我用它做免疫组化也出现阳性反应，效果还不错．想请教各位高手，可否就用免疫组化代替？是不是免疫荧光的敏感性更高？要发高质量的文章，免疫组化行不行？毕竟免疫荧光要求的设备高，有些难达到．请各位高手帮帮忙，谢谢！！！
免疫组化发文章是可以的。荧光技术的分辨率比酶染色法高，在敏感性方面由于荧光染料的猝灭会造成较弱的发射光，但是借助共聚焦扫描显微镜、高灵敏度照相机等分析系统，敏感性可以大大提高。
免疫组化当然可以发高质量的文章了，免疫荧光并不是说比酶组化更高级的方法，他们各有优势和劣势，关键在于你的方案要求从而进行选择。
|
|
|
|
|
|
|
|
