第三章工业菌种的选育工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造
目的：强化现存的优良性状去除不良性质
增加新的性状工业菌种育种的方法诱变基因转移基因重组育种过程包括下列3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下
，有益基因型的引入。(2)目标基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。选择育种方法时综合考虑的因
素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学特性认识的
程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及
生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。工业菌种改良途径(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：
通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。
(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。
(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。
第一节诱变育种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱
变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变一、诱变剂和诱变处理物理诱变剂：射线如紫
外线、X—射线、γ—射线，快中子，离子束等；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。对于一般实验室、中小型工厂都适用，
也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：化
学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1.大多数情况下
，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2.化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃
器皿，一个蒸气罩。3.大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触。二、诱变育种步骤(一)出发
菌株的选择1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也
是良好的出发菌株。3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的变异。4．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的
多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。5．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择
诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期
，就可选用孢子。(二)处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培
养，并要离心，洗涤，过滤。(三)诱变处理根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理
方案。(四)中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟
)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。方法：让变异处理后细
胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培
养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的
菌株退化。(五)分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以
质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.紫外线的诱变育种紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯波长为2537
A灯与处理物的距离为15～30cm一般为几秒至几十分钟一般常以细胞的死亡率表示照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜被照
射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深
，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应
在红灯下进行。(二)操作步骤1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离
心洗涤。2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装
入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm
培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，
然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。4．取未照射的制备菌液和照射菌液
各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r
／min振荡培养4～6h。6．取中间培养液稀释分离、培养。7．挑取菌落进行筛选。亚硝基胍诱变曲霉菌N—甲基—N
‘-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着
重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。
(二)操作步骤1．单孢子悬液制备取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振
荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液。2．
MNNG溶液的制备用分析天平称取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。3．诱变处理
吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀
释度分离培养，30℃3天后计数。4．死亡率计算将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30℃下
培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．第二节营养缺陷型的选育营养缺陷
型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异
株。与营养缺陷型对应的是野生型。能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；在基本培养基中加入相应的营养成分的称
补充培养基(SM)；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。营养缺陷型的用途
营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷
型的菌株为材料。筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱第三节其他育种方式杂交育种、原生质体育
种第四节筛选新的代谢产物一、开发新的代谢产物的途径(1)从自然界分离新的微生物菌株，或采用新的检阅方法筛选新的代谢产
物。(2)对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。(3)利用微生物转化改造代谢产物的结构。(4)通过原生质体融合获得新
的代谢产物。(5)DNA重组技术。二、筛选微生物新的代谢产物的程序突变型菌株的筛选一、产量性状突变株的筛选
三、筛选微生物代谢产物的目标筛选克服抗生素抗性菌株的活性物质；筛选抗肿瘤、抗病毒的活性物质；研究有药理活性的酶抑制剂及
免疫调节剂；寻找食品工业最好的酵母培养物；筛选降解有害物质的微生物以及治疗上具有低毒、长效的化学药物等。四、筛选微生物代谢
产物的方法(一)直接方法为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途，在体外试验测得活性后，可以将培养液的有效成分直接作用于机体，观
察被测样品的疗效。这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体内治疗试验。(二)间接方法筛选医用抗生素，可用细茵、真菌、病毒或肿瘤模型，寻找抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤抗生素、酶抑制剂、免疫制剂等有效物质。在预筛选时，多用琼脂平扳扩散抑菌法。通过预筛选，直接测定最初分离物的生物活性，能加速筛选过程。选讲内容离子束生物工程学研究进展和离子束诱变育种物理、化学或生物诱变方法出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选 |
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