[转载]细胞转染讨论

最好同时设计几对，选择效果较好的，别忘了做对照（GFP）,排除非特异性干预

1.不同的细胞及转染试剂对于质粒和脂质体的比例要求是不同的，所以在正式实验前必须摸索一个最佳转染比例。总的来说，细胞系较原代好转，脂质体的用量以说明书为参考上下浮动。 2.对于转染后的效应检测，体外直接合成的SiRNA多半在48h检测，也有72H的，但时间再长有可能降解而失去功效。对于用U6或H1质粒载体体内转录生成siRNA的，因为有一个转录时间，所以检测可以稍靠后；而且，与体外合成的相比，虽然载体也不能大量整合到细胞基因组中，但毕竟不会马上降解，Knockdown的时间效应相对要长，一般一周左右没有问题。所以可以在检测时做一个时间梯度，使实验数据更加丰满完善一些。（但要考虑靶细胞生长特性，疯长的可能效果较差）

一般在转染后4－6小时补加血清，可以就在你原来的无血清培养基中滴两滴血清。如果你觉得LF2000可能对你的细胞有毒性作用的话（一般LF2000的毒性不至于很大，可以不用更换培养基，具体看你细胞的生成状态了），你可以把原来的无血清培养基吸出来，更换成含血清的培养基。在转染后的4－6小时，最好不要动你的细胞，让它安静地躺着，因为此时细胞最为脆弱，不合适的动荡会使其死亡率增加。

lipofectamine2000转染后在6小时左右最好换液且换为有血清的血清，其一因为lipofectamine2000对细胞的毒性作用还是有的，其二可降低因血清的缺乏引起的细胞的死亡。转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入。加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡。可时时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。

转染全程都不应加有抗生素的，我刚刚做完LP2000转染的，把我的一点经验告诉你啊： 1.加完脂质体DNA混合物后细胞就出现小黑点，这很正常的，因为LP2000即使毒性再小它也是有毒性的，减轻的办法就是4－5小时把混合物去掉换有血清的新培养基培养，我做之前看有些战友的意见毒性大3小时换也行的。 2.我的是在无血清的DMEM下转的，推荐买OPTI-MEM，但到货一个月，我也没用，不过还可以的 3.多摸几个浓度比例，找出最适合的，如果有报告基因就最好了，但是我的也没有。 4.细胞密度要够哇，80％左右吧，我感觉细胞死的还挺多的。 5.按照LP2000操作说明来做，基本上没问题的。 6.这个我应该建议你在做之前搜索本版，好好看看战友的经验，绝对受益匪浅啊

RT-PCR检测转染

提取RNA中混杂有少量质粒DNA会出现RT-PCR假阳性。  排除方法：设一阴性对照，用提取的RNA（不经RT）直接作模板进行PCR扩增。

我准备研究某基因功能，构建了重组表达质粒（以荧光素酶为报告).现准备转染细胞，并以不含目的基因的质粒作对照。请问：  1.如果以beta-gal质粒共转染作内参，荧光素酶活性如何校正？  2.如果以beta-gal质粒共转染作内参，各种条件转染需作复孔吗？  3.各种条件转染均作复孔，结果经统计学处理，目的是排除孔间转染效率差异。是否还需要作共转染内参照？

为了简便，大多数的研究者，如楼上所说，把LUCIFERASE的活性值除以beta-gal的值就行了。但理论上讲是应该将内源性的beta-Gal活性扣除的，对于哺乳细胞，内部是有此酶活性表达的。所以，要设一个孔，任何DNA都不转染，然后把所有的beta-gal活性值都减去这个阴性对照的数值，最后把这个值与LUCIFERASE的活性做比，求出的比值为LUCIFERASE基因前面PROMOTER的活性。  PROMEGA有一种试剂盒，做内参照的不用beta-gal,是另一种LUCIFERASE，用不同的底物。这种酶在细胞内没有内源性的表达，结果更可靠些。  这个beta-gal一定要加，因为它是衡量转染效率的。它可是告诉你，是十个DNA转进去了，还是一百个。如果没有这个衡量标准，转进去了一百个DNA的LUCI活性当然强，如果跟转进去十个的比高不了多少，那事实上LUCI前的PROMOTER活性还是低。如果没有这个标准就会得出错误的结论了。  减去背景beta-Gal的时候不可直接减，要换成（活性/毫克）再减，这样相当于每个细胞里减去背景。同样的道理，做比值的时候也要把A值换成（活性/毫克）再与beta-Gal比。  不知说明白了没有。总之感觉处理数据很困难。总体的趋势应该和两值直接比差别不大（在背景比较小的时候。有的细胞背景就是高）。

有两种可能，一是LIPO对你的细胞毒性大，解决方法是五小时转染完成后，把转染混合液吸出，再加培养液。二是该细胞对你转染进去的质粒表达产物敏感，或是被诱导了APOPTOSIS，或是造成了DIFFERENTIATION，解决方法是换一种细胞，看这种现象是否发生

MTT检测的是细胞的活性,即活细胞数的相对量,不可能用来检测转染效率.MTT检测最后细胞都碎裂,如何继续培养.可做三个平行孔,分别24.48 72小时检测. 想做Western和，RT-PCR和流式的话，如果这些孔转染相同的质粒,当然可从其中几个孔的细胞做Western,再取另外几个孔的细胞作 RT-PCR，再取别的孔的细胞作流式？其实瞬转质粒的效果都不好,建议还是做稳定表达.

可考虑以下原因： 1.培养基必须在转染24小时前换用无双抗的。 2.质粒虽然是按说明书提取的，但要看清楚质粒提取试剂盒是否可以去除内毒素。 3.如果选用Invitrogen Lipofectamine 2000，它提供的参考步骤并不一定是你选用的培养板规格，须参照后面的列表． 4.培养板非常容易污染，必须排除微生物污染的可能． 5.可以考虑转染5小时左右吸去转染液体，换用含血清的培养基继续培养． 6.转染前你培养了多少时间？如果进行顺式转染，必须在细胞生长达到７０－８０％再进行转染

个人认为你还可以考虑以下方面： 1.请确认你的Lipofectamine 2000是否已经过期，经过我们实验室的实践：尽量使用开封半年内的Lipofectamine 2000，因为过了半年后，就算没有过失效期，但是细胞毒性大大增加，而转染效率却大大下降。 2.确认你在使用Promega质粒提取试剂盒是使用了内毒素去除树脂（Endotoxin Removal Resin）。 3.按照Promega质粒提取试剂盒的protocol，在第19步加入nuclease-free water后直接放入-20或-80度冻存就可以，我们没有另外沉淀。 4.去除质粒提取中的酒精可以试用下面的方法：将Ep管倒置在灭菌的滤纸上，大概10-20分钟后就可以干了，注意不要时间过长，否则太干了，不太好溶解。 5.你可以尝试适当减低转染试剂的用量，并在转染5小时时观察细胞情况，并且换10％FBS的培养基，看看情况怎么样，因为转染液对细胞的损伤非常大。祝您实验成功！

各种培养细胞或细胞株对转染试剂的毒性敏感程度不一样, 脂质体的毒性大一些, 如果是转染试剂的问题,建议使用毒性低一些的转染试剂,如阳离子聚合物转染试剂，可以试试梭华-sofast。

http://www./newsf/2003-9/B2003917143939.htm 1.高质量的siRNA（或者是siRNA表达工具，比如质粒，PCR片断等） 2.有效的转染试剂。如何选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。常见的转染试剂包括脂质体和多胺类的试剂，主要是为双链DNA转染而设计的。转染质粒DNA的最佳试剂往往不适合siRNA的转染，反之亦然。适合于质粒DNA转染用的转染试剂往往也不适合siRNA表达框（SECs: PCR fragments expressing siRNAs，参考RNAi：制备siRNAs的5种方法——如何选择最适合你的方法）的转染。随着RNAi技术越来越受重视，各厂家纷纷推出了自己的RNAi转染试剂。一：siRNA专用转染试剂 （二：质粒和PCR片断专用转染试剂）产品名：RNAiFect Transfection Reagent 厂家：Qiagen 优点：高效低毒；适用细胞广泛；即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染，操作格外简单方便简介：siRNA的转染是基因沉默实验中关键的一步。RNAiFect是一种基于脂质的转染试剂，专门用于siRNA转染，确保没有RNAse活性。传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。由于RNAiFect的内毒素和细胞毒性都非常之低，加上转染复合物能够高效的在完全培养基中形成，因而整个转染过程可以在含血清而且是含有抗生素的培养基中操作，无需更换培养基，这极大的方便转染操作！该试剂可以耐受较高浓度的siRNA转染而不引起细胞毒性，能够得到更好的抑制效果，适用于包括AGS, HEK-293, HeLaS3, Huh-7, HUVEC, NIH-3T3, and mouse embryonic fibroblasts cells在内的多种真核细胞。操作流程： 1.用含有抗生素和血清的培养基，或者是附带的Buffer EC-R稀释siRNA  2.加入RNAiFect转染试剂，在室温下混合并孵育10—15分钟  3.加入培养细胞中即可。24—48小时后检测siRNA的干扰效果。  参考数据： HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6 x 104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit with primers targeted to lamin A/C and GAPDH. Expression of the lamin A/C gene was normalized to the expression of GAPDH and quantified using a standard curve prepared from known amounts of cDNA purified from HeLa-S3 cells.  Cells were transfected and LDH activity in the cell culture supernatants was tested 48 hours later, using a colorimetric assay according to the manufacturer’s protocol. LDH activity in the cell culture supernatant of untransfected cells lysed by detergent was set to 100%. Background LDH activity was measured in untransfected and untreated cells, and this value was subtracted from all other measurements.  Name Details Cat. No. 价格  RNAiFect Transfection Reagent, 1ml RNAiFect Reagent 1ml and bufferEC-R, for up to 170 transfections in 24-well plates; up to 500 transfections in 96-well plates 301605 2501  操作手册：RNAiFect Transfection Reagent 操作手册产品名：TransMessenger Transfection Reagent 厂家：Qiagen 优点：高效转染；RNA专用即用型试剂；简介：TransMessenger是第一个专门为转染RNA而设计的非脂质体的脂质型的转染试剂。没有RNase活性，内毒素≤10 EU/ml，经严格设计去除所有可能降低RNA转染效率的成分，确保高效转染。独特的缓冲液促进RNA聚集，经脂质体包装成为高效转染复合物。适用于包括293, BSC-1, MA104, MRC, Primary cortical and hippocampal cells, TRM-6 and TRM-6/PDX-1 cells, TU7D, Vero在内的多种细胞。操作流程：将RNA和Enhancer R，Buffer EC-R室温混合5分钟，加入TransMessenger Reagent室温孵育5—10分钟，加入培养基混合后加入细胞中，再温育培养3小时，更换培养基继续培养直到检测。操作手册 TransMessenger? Transfection Reagent Handbook (PDF version, 83 K 产品名：The Silencer siRNA Transfection Kit: siPORT? Amine 和 siPORT? Lipid  厂家：Ambion  优点：专为siRNA转染不同细胞类型而设计简介：目前主流的转染试剂类型主要是脂质类和多胺类两种，由于不同的细胞“偏爱”不同类型的转染试剂，因而对不同的细胞株的转染效率可能大相径庭，另外转染效率也和被转染的大分子类型有关（dsDNA, RNA, dsRNA, Oligo...）。siPORT Amine (a polyamine mixture) 和 siPORT Lipid (a mixture of cationic and neutral lipids)是专门为siRNA转染哺乳动物细胞而设计的。正如前面提到的，两种不同的类型对不同的细胞株有不同的表现：例如 siPORT Lipid 转染Hela的效率明显更高，而 siPORT Amine 更适合转染293细胞。两种转染试剂的细胞毒性都很低，非常适合转染包括化学合成的siRNA，以及体外转录或者长片断双链RNA由RNAseIII/Dicer酶降解制备的siRNA库在内的小分子RNA。The Silencer siRNA Transfection Kit中分别提供了这两种不同类型的转染试剂，方便实验人员在遇到各种细胞株时都可以分别尝试两种试剂，找到最适合的转染产品和方法，因而适用范围更宽。另外试剂盒提供针对GAPDH的siRNA的正负对照，用来检测转染的情况，比较适合初次使用。试剂盒的组分也有单独提供的。操作流程：用OPTI-MEM I reduced serum medium（Gibco）培养基稀释转染试剂，室温孵育10—30分钟，加入siRNA，再室温孵育15—20分钟。（洗细胞）加入培养细胞中，4小时后加普通培养基(e.g. DMEM with 10% FBS)继续培养直到检测。  Figure 4. Delivery of siRNA by siPORT Lipid and siPORT Amine Induces RNAi. The indicated cell types were transfected with GAPDH siRNA or negative control siRNA using either siPORT Amine or siPORT Lipid Transfection Agent. Bars indicate gene expression levels 48 hours after delivery of the gene-specific siRNA relative to negative control wells. 订货信息（点击产品名可以直接在生物通商城订货）：产品名（点击可直接定购） 用量 货号 价格  Silencer Transfection Kit 每种0.4ml，24孔板可做200次转化以上 1630 5987  siPORT Amine Transfection Reagent 0.4ml，24孔板可做200次转化以上，或者6孔板100次转化以上 4502 2783  siPORT Lipid Transfection Reagent 0.4ml，24孔板可做200次转化以上，或者6孔板100次转化以上 4504 1602  产品名： GeneEraser? siRNA Transfection Reagent 厂家：Stratagene 优点：专门为siRNA转染多种细胞而设计，高效转染，只需低浓度siRNA；毒性更小，操作简便；简介: RNAi实验要求专门为siRNA转染而优化的转染试剂，GeneEraser正是这样一个产品，可以高效直接将siRNA运送到细胞质中以便和mRNA结合并引发mRNA降解，只需要很低浓度的siRNA就可以使特定的基因表达沉默。在Hela细胞中的转染效率可高达95%—100%。相比很多阳离子脂质体转染试剂，GeneEraaser低毒性可以显著减少对细胞的伤害。适用于包括CHO-K1，NIH/3T3，HT-29，A549，293，Hela，Monkey Kidney在内的多种细胞。可以在有血清的培养基中转染，无需更换培养基。操作流程：用无血清培养基稀释GeneEraser，室温孵育5—15分钟，加入siRNA再室温孵育5—15分钟；将转染复合物加入刚刚更换新鲜培养基(含血清)的细胞中，继续培养直到检测。操作手册：GeneEraser? siRNA Transfection Reagent手册 *************************************************** 产品名：Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent 厂家： Invitrogen 优点：高效低毒，耐血清，易于操作，适用范围广简介：Lipofectamine? 2000是Invitrogen公司著名的DNA转染试剂，在RNAi技术日益普及的今天，Invitrogen公司特地为其推出适用于siRNA转染的Protocol，使之同样能高效转染siRNA。两个关键性特点使得LIPOFECTAMINE 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，以及（2）转染后不需要除去Lipofectamine? 2000试剂。适用于包括HEK 293, BHK, CHO-K1,和A549在内的多种细胞。操作流程：用无血清培养基分别稀释siRNA（20pmol）和Lipofectamine? 2000，室温孵育5分钟后，混合，继续孵育20分钟，直接加入培养细胞中，继续培养直到检测。

操作手册：Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent用于siRNA转染的流程 ***************************************************

产品名：RiboJuice? siRNA Transfection Reagent  厂家：Novagen

简介：专门为siRNA转染优化设计的转染试剂，高效转染，低毒设计，适用于包括Neuro-2A， BHK，COS-7，MCF-7，NIH，3T3，A549，HeLa，HEK293，CHO，HepG2，L6在内的多种细胞。还可以和DNA转染试剂一起实现siRNA和DNA质粒的共转染，便于衡量转染效果。操作流程：无血清培养基稀释RiboJuice，静置5分钟后加入siRNA，孵育5—15分钟后直接加入培养细胞中，继续培养直到检测操作手册：RiboJuice? siRNA Transfection Reagent操作手册 *************************************************** 据厂家资料显示可以做RNA和Oligo转染还有不少产品，包括：罗氏公司的Fugene 6（这也曾是本人至爱）和DOTAP转染试剂， Promega公司的TransFast和Tfx，Transfetam转染试剂，Invitrogen公司可以用于转染RNA的DMRIE-C转染试剂，和转染寡核苷酸专用的Oligofectamine，也可以用于RNAi实验，但是很遗憾，由于资料不全，没有找到这些产品用于RNAi实验的具体应用，所以我们在此暂时不作介绍。　二、siRNA构建质粒和PCR片断转染试剂产品名：siPORT? XP-1  厂家：Ambion 简介：号称是RNA公司，也是最早投身RNAi领域并致力生产和推广RNAi相关技术和产品的Ambion公司，率先推出商品化的siRNA表达质粒（可以通过质粒方便的在细胞内表达siRNA）和PCR产物直接转染细胞制备siRNA的方法，同时也为这两种方法提供了专用于siRNA构建质粒和PCR片断的转染试剂siPORT? XP-1。这个多胺类的转染试剂毒性低，易于使用，能够在有血清的条件下高效的将质粒DNA或者PCR片断转到哺乳动物细胞，不需要更换培养基。多数质粒转染试剂不适合较短的线性DNA的转染，而XP-1是专为SECs和PCR产物转染优化设计的，结果更有保证。 Figure 3. SECs Delivered with siPORT XP-1 Induce Gene Silencing. siRNA Expression Cassettes (SECs) were prepared with the Silencer Express (Mouse U6) siRNA Expression Cassette Kit and then transfected into HepG2, COS-7, MCF-7, HeLa, and DU145 cells with siPORT XP-1. Gene silencing effects were monitored by Northern blot 72 hours after transfection. Figure 3 shows the use of siPORT XP-1 for transfecting SECs targeting GAPDH into five different cell lines. GAPDH mRNA levels were reduced by >90% in three of the five cell lines, and >75% in the remaining two. ( pSilencer 2.0-U6 was engineered to express an siRNA to GAPDH and then transfected into COS-7, HeLa and DU145 cells with siPORT XP-1. 72 hours after transfection, RNA was isolated and GAPDH mRNA levels were analyzed by Northern blot  操作流程：无血清培养基稀释转染试剂，静置5-20分钟后加入DNA或者PCR片断，孵育5—20分钟后直接加入培养细胞中，继续培养直到检测。操作手册：siPORT? XP-1操作手册产品 货号 描述  siPORT XP-1 （0.4ml） 4605 24孔板转染可用200次以上  　在本次测评中综合指数没有转染效率一项，原因是根据各厂家的阐述很难评出其差别，siRNA抑制基因表达本来就是一个和试剂量有关的过程，不同的细胞株，不同基因，不同的siRNA和不同的siRNA量，不同的操作都会影响实验的结果。有的转染试剂“耐受”RNA少，或者说载量较小，要增加siRNA的量就要相应增加转染试剂的量，影响转染，有的试剂可以承载较多的RNA，容易得到较好的结果，因而难以客观的评价。很少有实验室能有机会“用遍”各种产品。不过不同的实验室会选择不同的产品，有自己的使用心得，如果能将这些心得汇集起来，对于后来的新手将是非常实用的参考。要成功的进行siRNA的转染实验，除了要选择适合的转染试剂外，还需要对实验条件进行优化，包括siRNA浓度，质量，细胞密度，血清的浓度以及转染试剂的量

可能你某个环节有污染，或者脂质体，或者质粒，或者培养基，最后就是你的器皿和操作。首先你要排除这些问题，你应该做对照，就是单加质粒，单加脂质体，单加培养基，最后器皿全部重新消毒。这样子观察几个小时就可以知道是哪个物质加进去后会导致细胞死掉。其次，你转染后一般4个小时就可以了，不要太长时间，还有我一个同学总结的经验是加脂质体的过程中，要每加一点就混匀一下，这样子，对细胞的损害小些。试试吧，看能否解决你的问题。

首先，转染细胞用的质粒必需保证无菌，一般的质粒提取试剂盒都不能做到这一点，我们通常都会将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了，离心后，再在超净台打开，用无菌水之类溶了，这应该是最常见的做法了。其次，现在一般脂质体如lipo2000都是建议带血清转的，毒性很小，大多数转染导致的毒性都是提质粒带的大肠杆菌裂解出来的内毒素，者这对原代细胞会产生很大的影响，而你提到的MDA-MB-231,Bcap-37,MCF-7三个都是细胞系，对内毒素不敏感，我转MCF-7随便用哪个盒子都能活的很好。现在也有不少公司，比如Qiagen，天为时代，卖的试剂盒都是去内毒素的，这样的试剂盒对转原代比较好。

1、 保证细胞活力最好  2、如果条件允许的话加点优胎血清  3、可以考虑置换培养掖  4、质粒纯度  5、质粒的比例可以考虑适当减低，因为一般来讲，质粒是够的  6、两种质粒的比例要摸，另外，egfp要在24-48小时之后才大量出现，并且有一个表达期  哪位朋友知道有什么好的关于转染的资料或者网站么？相关网站：  http://www./products/transfection/index.shtml  http://www./products/families/index.shtml  http://www./catalog/country_select.asp?/transfectionasst/Default.htm&ckt=2  http://www./catalog/country_select.asp?/tbs/tm012/tm012.html&ckt=2  http://www./htm/products/transfection/trans_main.htm  http://www./catalog/transfection/  http://www./profiles/transfection/  http://www./otherproducts/transfection1.htm

Lipofectamine 2000具有较强的细胞毒性。如果是细胞系转染，建议在加入Lipofectamine 2000后2-4小时换液，往往能取得不错的结果。另外厂家推荐的转染试剂使用量似乎偏高，建议少用。 

转染时用无血清无抗生素的1640培养液是正确的，关键是你转染的时间太长了，一般情况在转染后4到6小时，应去掉转染试剂，加入含有血清的1640继续培养24 小时，这样才能继续后面的实验，Lipofectamine 2000还是很好用的。你可同时做个对照组，转染一个荧光蛋白进去，观察转染的效率！

MCF－7很好转，转个5，6K的质粒效率都很高 1 ）用lipo2000转,转染前细胞状态一定要好，lipo2000也不是一定只转增殖细胞，但是在转染前几个小时换个液刺激一下是个不错的主意。 2） 我用lipo2000转染大多数细胞的经验是有血清比无血清要好，你可以自己去试。 3） 关于换液的问题，像MCF－7之类的细胞系对质粒带的内毒素都不太敏感，lipo确实有那么点毒性，减半不会显著降低效率。而我对这类细胞从来都不换液，因为没差别。 4） 效率低可能的原因很多。就质粒而言，质量一般问题不大，主要是量的问题，不知你定量准不准，如果加大质粒量能提高效率，那么有可能你的质粒纯度不行，影响读数，这里就不多说了。

1 细胞瞬时转染后,有关转染效率的检测指标有那些?

1 我是用pEGFP-N1质粒转染细胞36小时后，将细胞固定后用DAPI染细胞核，然后荧光显微镜下观察并照相。细胞瞬时转染效率=EGFP阳性细胞数/DAPI阳性细胞核数。取5个视野均值用来估计细胞瞬时转染效率。 2 应该不会，没有看到相关报道 3 为什么不直接测量目的基因？如果你用的细胞瞬时转染效率不高，最好通过筛选建立稳定转染细胞系。  用绿色萤光蛋白载体是否可以共同携带目的基因和-myc.以便转染后用-myc的抗体就可以验证目的基因的转染量（而不用特异而专一的目的基因的抗体）

如果做稳定转染，建议你不要直接做相关指标检测！一般是在转染后一定时间（具体时间与你转染试剂和筛选基因所表达的蛋白时间相关，我的是G418筛选，48－72小时），按一定的比例吧转染后的细胞分六孔板（具体比例与细胞生长情况和转染效率有关，由预试验而定）进行加药筛选！（筛选浓度预实验定）挑选单克隆，并且加药维持筛选（维持浓度为其筛选浓度一半），然后24孔板、6孔板、培养瓶扩大培养。挑选单克隆后，选多个单克隆就可以做下一步的试验了！至于转染时间和质粒剂量，首先看看说明书，其应该有个明确的范围，然后你在其中做几个浓度，做一下预试验！ GOOD LUCK！！！

首先得明确OD260/OD280比值的意义 DNA在1.8最纯，一般在1.6-1.8都是可以接受的，如果大于1.8的话，说明可能有RNA的污染我个人觉得，由于提取质粒的时候加过RNA酶，所以存在RNA污染的几率不大，DNA最后的吸光度比值在1.6-1.8更可信一些。而且，关键是转染用质粒的DNA浓度，是用OD260转换出来的，浓度高一些，经验上转染效率会相对更好一些。组成核酸分子的碱基，均具有一定的 吸收紫外线的特性，最大吸收值在波长为250－270nm之间。例如腺嘌呤的最大紫外吸收值在260.5nm,胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.4nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖，磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡聚核苷酸为20ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。分光光度法可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260／A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。我也是从书上找来的，共同学习！分子克隆上有相关的说明. 真核转染要求DNA的质量体现在OD260/OD280的比值,还要求最好为超螺旋.也有的文献说dna线性化之后,转染的效率会提高. 数量体现在OD260值上.]所以真核转染影响因素还是挺多的，OD260/OD280也只是其中之一。还有一点就是做转染的时候，一般都会选择试剂盒进行抽提，保证DNA的纯度以及量；还有就是去除内毒素。但是我们用普通的碱裂解法，经过二次酚氯抽提得到的DNA样品，进行转染，效果一样不错。所以试验这个东西恐怕和楼主的感觉一样：仁者见仁,智者见智吧。呵呵

转染用的质粒首先要保证数量，一般为2微克以上。其次是你的质粒大小，如果是较小的质粒，你可以直接用华舜的试剂合抽提，如果你的质粒大于1万bp的话，就要用酚/氯仿/氯仿抽提。第三你的细胞如何，一般在细胞融合到70%左右转染细胞最好，贴补细胞悬浮的较少。第四，你的脂质体用量不要太大，在转染前要先用无血清的培养液冲洗和孵育。一定要在无血清的环境中转染，在四个小时后悬浮细胞较少的话一定要换培养液。含有什么问题再讲。

可以先用RT-PCR试一下，不过不到10%的转染率要想在蛋白水平上有所改变，估计够呛，进行下一步的功能测定几乎不太可能。以前我转染悬浮的血液肿瘤细胞效率大概差一点20%，G418筛选效果还可以，我觉得你可以筛选试一下，如果你的有荧光表达可以用流式筛选，效果应该更好。

质粒转化感受态细菌 质粒转染细胞 病毒感染细胞

转染(transfection):1.感受态细菌细胞受无外壳的噬菌体DNA的感染,发生转化作用,然后产生忧感染性的噬菌体.只是DNA而无蛋白衣壳参与.2.在组织培养中,指外源DNA被引入真核细胞. 转导(transduction):通过噬菌体将供体的细胞的DNA转到受体细胞而因其基因重组作用转化(transformation):受体细胞的染色体中嵌入一段外源DNA而产生的具有重组作用.

1. 转染(transfection):指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程.进入细胞的外源DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中也可以在染色体外存在和表达. 2.转化(transformation):指质粒或其他外源DNA导入处于感受态的受体细胞并使其获得新的表型的过程. 3.转导(transduction):由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程称为转导.

2. 进行真核转染的一般程序：克隆目的基因（经测序验证）－准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、试剂准备 1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 （一）克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5‘-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。（二） 真核重组表达载体的构建： pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切 回收插入片段和pcDNA3线性片段 T4连接酶连接 转化DH5α 质粒制备 BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。 （三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞： 1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。  2、 在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。典型贴壁细胞平板密度  培养板大小    生长面积（cm2）   大约细胞数   培养基容积（ml 组织培养皿（φ60mm） 28        6．6×105      5-6  6孔培养板（φ35mm） 9.5        3. 0×105      1-2  12孔培养板φ22.6mm） 4        1．3×105       0．5-1  24孔培养板（φ8mm） 0.5        0．6×105      0．25-0．5

3. 真核转染  一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：（1） 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。（2） 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。（3） 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。（4） 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的情况。（5） 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。（6） 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为mRNA的基因组序列得到表达。（7） 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。 DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。进行真核转染的一般程序： 克隆目的基因（经测序验证）－准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、试剂准备 1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 （一）克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5‘-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。（二） 真核重组表达载体的构建： pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切 回收插入片段和pcDNA3线性片段 T4连接酶连接 转化DH5α 质粒制备 BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。 （三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞： 1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。  2、 在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。典型贴壁细胞平板密度  培养板大小   生长面积（cm2）   大约细胞数   培养基容积（ml）  组织培养皿（φ60mm）   28   6．6×105   5-6  6孔培养板（φ35mm）   9.5   3×105   1-2  12孔培养板φ22.6mm）   4   1．3×105   0．5-1  24孔培养板（φ8mm）   0．5   0．6×105   0．25-0．5  3、 SHG-44细胞的转染： (1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。 (2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。① 溶液A：用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5μg到总体积50μl（30μg/ml）。②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl（120μg/ml）。③混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。 (3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。 (4) 37℃孵育6hr。 (5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。 4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。（一）筛选结果鉴定： （1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western-blot）。（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响 ①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。 ②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。 ③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。三、注意事项 1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。 2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。 3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。

4. 这两种试剂我都试过,主要看你的细胞类型,有些细胞转染比较困难,一般来讲2000的效果可能会更好些, plus的毒性稍大,没必要在2000中加plus,至于转染用量试剂说明书给了参考量,基本可信,当然如果你想优化一下转染条件,追求更高的转染效率,1.可以查一下相关的文献,如果运气好,会有相同的实验设计可供借鉴.2.如果经济条件允许，老板愿意，登陆公司的网站,上面提供详细的优化指导.要费些事、花些钱，但对完成今后的实验、取得理想的结果，可能是必要的。顺便说一句:由于实验条件、操作技巧以及其他因素的影响，可能实验结果与文献等的转染结论不同，这很正常，可能这才是科学！祝实验顺利！

5. 我做的脂质体介导的转染，G418筛后两周多出现多个肉眼可见的克隆，我将其挑到96孔板中，我试用了不同的方法，如枪头、蘸胰酶的滤纸、针灸的针等，我想向各位请教： 1、克隆长到多大时挑合适，是不是越小越好。我感觉我挑时有点老，细胞太多了。 2、96孔板内每孔放多少个细胞合适？如用有限稀释法仅放一两个细胞肯定不行，长不起来，我觉得得放10个以上的细胞才长的动。有限稀释法在挑单克隆时具体怎么做？ 3、我用滤纸挑后，在孔中看到有好些滤纸纤维，漂在活细胞上面，要紧吗？滤纸挑出的细胞是否太多，因为滤纸接触面积大。针尖挑不到细胞，怎么挑？ 4、做单细胞克隆，可以看什么参考书目或资料，推荐一下。 5、我看到精华版的转染讨论，丁香蔷薇师姐是用的6孔板中的克隆消化下来再筛，我也留了一个孔未挑，准备试试这个办法，不知是否与挑单克隆效果不相上下？ 6、挑单克隆，最后目的基因表达是否可达到100％？为什么挑单克隆时容易挑不纯？ 7、无抗性的质粒做的包被逆转录病毒载体感染目的细胞，体外能持续表达多久？挑单克隆与做流式细胞筛选的效果是否相否相仿？多谢！脂质体在室温下暴露的时间不要太长，和DNA混合的时间不宜太长。  转染失败有几个方面的因素：  一：细胞状态不好，一般细胞应该是贴壁率在50-80%，悬浮细胞的话一般是6X100000个/孔（24孔板），一般是转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。二：质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质，这个时候应该对质粒进行纯化和浓缩三： 在有就是你是通过什么方法鉴定转染效率或者成功与否？是不是脂质体和细胞共培养时间太长，我一般再12小时左右，当然不同公司的转染试剂不一样四：就比例而言，一般是转染试剂：质粒为3-6ul:1ug，这也得是具体情况而定. 五：至于实验方法，要看你的细胞系类型，一般试剂都会有说明书我用过lipofectin lipofectin2000,GeneJuice 有时间可以写信交流俺做的病毒转染： 35mm培养皿，60％－80％ 单层贴壁，没有做过悬浮的。细胞贴壁一个小时以上，最好过夜贴壁。转染前用双无（无抗无血清）培养基1毫升洗两次。俺用的脂质体是cellfectin，10微升左右用100微升的双无培养基稀释，DNA用量1－5微克，同样用100微升双无培养基稀释，然后再把它们两混匀，室温放置15－45分钟。然后加到培养皿里，4－6小时后全部换回正常血清培养基。我也做过转染，做的也是RNAi,先用的是某公司的脂质体，不是lip2000,做了两次预实验都没成功，转染率很低，后来换了梭华一次就成功了，同时转染了三株细胞，转染效率都很高。又便宜又简便。用公司推荐的最佳浓度即可。另外，我觉得混合脂质体与载体的过程可能对转染效率有很大影响，脂质体用培养基稀释要快，与载体混合也要快，一边混一边轻轻吹，以保证脂质体尽可能的包裹载体。

6. 目前关于载体质粒转染的检测，一般是在载体上加入一段报道序列（使用的较多的是绿色荧光蛋白green fluorescent protein,GFP），这样，不论是体外基因治疗或者体内转染，都可以非常直观的利用荧光显微镜看到目的基因的位置以及表达情况。目前外源性DNA转染最常用的方法是使用脂质体（我们实验室使用的是Invitrogen Lipofectamine 2000，效果非常不错，效率比较高），脂质体转染的方法相对简单，而且可以获得比较满意的转染效率，转染后的细胞可以继续后续处理（比如流式细胞术flow cytometry,MTT等）。以下是我前段时间做的转染图片，使用的细胞是肝癌7721细胞，Invitrogen Lipofectamine 2000，转染24小时后的图片，希望能给各位战友参考！谢谢！另外：这张图是做的顺式转染，效率相对稳定转染要低很多  转染常用的报告基因　　报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。　　作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 1、胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs) 2、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat) 3、荧光素酶基因（luciferase Gene） 4、β-D-葡萄糖苷酶基因 5、绿色荧光蛋白（gfp）基因等。首先，要选择好的转染试剂（我用的是Invitrogen的lip2000 转过原代细胞，也转过细胞系，效果都不错），再就是用于基因沉默的重组载体的纯化要用级别较高的试剂盒（一般都得去除细菌内毒素），再就是确定好转染试剂和质粒的比例（一般转染试剂盒中都有说明）。其次，转染过程中转染试剂和质粒混合形成复合物的过程中，要确保用的是无血清培养基。对于敏感的细胞，复合物孵育4-6h后最好完全弃去板中培养基，换成有血清的培养基。转染后基因沉默的检测主要是转录水平和翻译水平的检测。转录水平的检测有Northern，RT-PCR，翻译水平的检测有WB,免疫组化，免疫荧光。想你应该设计合适的对照。建议用带EGFP基因（或GFP）的pCDNA3质粒为对照。用你上述的转染方法，只是加G418的时间不必等到第四天。转染后48小时就可以了。转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞在24小时后应该观察到绿色荧光，同时可以判断一下转导效率；同步转染和加压筛选，观察转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞是否会全部死掉；如果同样也死掉了，说明质粒可能有问题，或转染方法有问题（看不到绿色荧光）；如果转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞加压后不死，并形成了抗性克隆，至少有些细胞克隆还仍有绿色荧光，而转染了pCDNA3-P53质粒的细胞都死掉了，则说明不是转染或质粒的问题，而是P53基因的表达使细胞发生了凋亡，这正是P53基因的功能。所以你不必试图获得表达P53基因的肺成纤维细胞，即使获得了抗性克隆，也可能恰恰不是你要的细胞，因为它们已经都凋亡了。以上意见供你参考。

7. 1、细胞活力最好时转  2、质粒量与脂肢体的比例要适宜，而且质粒量小的较好  3、细胞数合适  4、转染后及时换液  5、适量加大血清

8. 应该说两种转染试剂各有千秋吧，要视乎你的要求、经济情况进行选取。 invitrongen 的lipofectamine 2000优点是适用范围广泛，适用于DNA、siRNA、dsRNA、RNA等在内的核酸转染，并且可适用于500多种细胞株，具有一剂多用之效；用量及价格上来说，对于一般的24孔板转染每次约需2ul，0.75ml规格的大约可做375次，市场价约2800元左右（视乎阁下的侃价功力），就性价比而言还算不错。而Qiagen的HiperFect是RNAi的专用转染试剂，具有灵敏、高效、方便等特点，可以在siRNA低至100pM浓度的条件下转染，既可保持高效的基因沉默又可减少副作用，并且整个转染过程简便，从接种到检测结果可在一天内完成，对于高通量反应尤为方便。但是价格较贵，0.5ml大约2800元，可做170次24孔板转染（每次需3ul）（建议等他们公司每年两次的特价活动时购买^_^）至于细胞毒性，lipofectamine 2000要求细胞铺板密度较高，以90～95％为佳，否则影响还是较大；HiperFect还没用过，但就其可以在siRNA低至100pM浓度的条件下转染来看，这种工作效力还是可以减少副反应的。另外，建议可以考虑一下Qiagen的另一个产品：RNAiFect，细胞毒性超低，价格也适中，也是目前唯一一种可以用含抗生素的完全培养基全程操作的siRNA转染产品。1ml约2300元，24孔板可做170次转染（每次6ul）。本人正在用此产品。个人看法，请指教。

9. LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤  此实验步骤设计用来进行24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。  1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中（参见表6了解建议的细胞密度）。 2. 对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为LIPOFECTAMINE 2000的稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（由第2步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第3步）。在室温保温20分钟。  注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。  表6. 在24孔板中转染Invitrogen细胞系的推荐使用量 Table 6  Cell Line Cill/well(×10) LIPOFECTAMINE 2000 Reagent(μl)  CHO-S       1.5                   2.5-3.0  COS-7L      0.8                   2.5-3.0  293H,293F    2.0                   1.5-2.0  5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。 6. 在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。  贴壁哺乳动物细胞的DNA转染步骤  此步骤专门设计使用LIPOFECTAMINE，LIPOFECTIN，DMRIE-C或CELLFECTIN试剂在6孔板转染贴壁的哺乳动物细胞。  使用这些试剂时，欲得到最佳转染效率，条件的优化必不可少。参考右侧阳离子脂质体试剂和DNA优化步骤。健康的，正在增生的细胞和恒定的细胞密度对于可重复性的结果不可或缺。  1. 转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数并铺板，使转染日细胞融合度为70-90％。在铺板和转染期间避免使用抗生素。 2. 对每孔细胞，在100μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ或D-MEM）中稀释1-2μg DNA。如有多孔细胞，可以批量制备。 3. 在每孔中，用100μl无血清的培养基稀释2-25μl阳离子脂质体试剂。阳离子脂质体试剂的每次稀释都使用单独的管。对于LIPOFECTIN，必须使用OPTI-MEMⅠ稀释并将稀释液在室温保温30分钟。 4. 将稀释的DNA（步骤2）同稀释的脂质体试剂（步骤3）混合。在室温保温15分钟。 5. 使用0.8ml/孔的转染培养基在转染开始前清洗细胞。转染培养基中可以含有血清。 6. 使用转染培养基稀释复合物至总体积1ml/管。将稀释的复合物加入细胞。5% CO2，37℃保温5小时。 7. 5小时后，增加培养基的体积至正常体积。如果转染培养基不含血清，加入血清，使其终浓度达到正常生长培养基的浓度。如欲使细胞生长最佳，使用新鲜的完全培养基替换含有复合物的培养基。 8. 转染24-48小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。注意：当转染不同大小培养板中的细胞时，根据表面积相应改变细胞，DNA，转染试剂以及培养基的量（参见表1）。  阳离子脂质体试剂和DNA的优化步骤  当使用除LIPOFECTAMINE PLUS试剂外的其他阳离子脂质体试剂进行转染时，如欲得到最佳转染效率，精心的优化必不可少。本实验步骤可以确定使用LIPOFECTIN，CELLFECTIN，DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂所需的最佳脂质体试剂和DNA的量。  保持恒定的细胞密度以得到可重复的结果。阳离子脂质体试剂和DNA复合物在96孔板中制备（因为体积很小），然后加入24孔板中生长的细胞。转染的培养板按如下方式设置：  1. 转染前一天在24孔板中进行细胞铺板，使转染日细胞融合度为70-90％。 2. 在6个小离心管中，根据下表使用无血清培养基稀释阳离子脂质体试剂（其足够用于5孔细胞转染）。仅对LIPOFECTIN试剂，需要在室温保温稀释液30分钟。  Tube/Colum(μl) Volume Dilution Medium(μl) Volume Cationic Lipid Reagent  1                   120                            5  2                    117.5                         7.5  3                  115                             10  4                  112.5                          12.5  5                  110                            15  6                 107.5                           17.5  3. 将25μl稀释的阳离子脂质体试剂（步骤2）加入96孔板相应列的4个孔中（如上面图表）。 4. 在小离心管中，在140μl无血清培养基中加入下列量的DNA进行稀释。（足够用于7孔细胞转染。）  Tube/Row DNA(μg)  A 1.4  B 2.8  C 5.6  D 8.4  5. 在96孔板上每隔6孔（沿底部），在管A取出20μl加入。对管B，C和D重复同样步骤。将样品按上面图表所示排布。在室温保温15分钟。 6. 将要转染前，使用新鲜转染培养基清洗细胞。在加入稀释的复合物（步骤7）前除去清洗液。 7. 在含有DNA-阳离子脂质体试剂复合物的96孔板上，每孔加入160μl转染培养基（含有或不含有血清）。稍加混合。建议检测有无血清存在时的活性。 8. 将复合物加到24孔板的细胞中。 9. 5%CO2，37℃保温5小时。5小时后，加入含血清的完全培养基，使血清终浓度等同于正常生长培养基。如欲使细胞生长最佳，使用新鲜的完全培养基替换含有复合物的培养基。 10. 转染24-48小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。注意：一旦确定了优化的条件，转染实验可以根据培养板表面积增加的比例线性放大（参见表1）。6孔板中得到的优化条件已经成功放大到100mm平皿上。建议的阳离子脂质体和DNA量的范围列在下面（表11）。  表11. 使用LIPOFECTIN，CELLFECTIN，DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂进行转染的用量范围 Table 11  Culture Vessel DNA(μg) Cationic Lipid Reagent(μl) Transfection Medium Volume  35-mm      1-2              2-25                          0.8  60-mm      3-6              6-75                          2.4  100-mm      8-16           16-200  转染细胞的β-gal原位染色  1. 此实验步骤针对固定细胞β-gal表达的检测。这是用来确定转染效率的方便快捷的方法。此方法在6孔板上进行，由Sanes的方法修正而来。对于不同大小的培养器皿，根据培养板的表面积比来扩大或缩小溶液的量（参见表1）。此步骤可以用于悬浮细胞。使用2×106转染的细胞（来自6孔板转染），轻轻将细胞离心下来，使用和培养板上润洗细胞相同的方法。轻柔地处理细胞，不能振荡，并以尽可能低的速度离心。  贮液： 20mg/ml的X-gal溶解于二甲亚砜（－20℃，贮存于聚丙烯试管中，避光）。注意：用玻璃移液管或者聚丙烯吸头来定量二甲亚砜溶液。二甲亚砜能溶解聚苯乙烯。 50mM铁氰化钾（贮存在4℃）。 50mM亚铁氰化钾（贮存在4℃）。  工作液：固定液：含有2%甲酰胺，0.05％戊二醛D－PBS（贮存于4℃）  配制方法如下： 85ml蒸馏水 10ml不含钙和镁的10X D－PBS（Cat.No.14200-075）（27mM KCl，11mM KHPO4，1.4mM NaCl，81mM Na2HPO4·7H2O） 5ml福尔马林（37％甲醛溶液） 0.2ml戊二醛（25%溶液）  染液：含有5mM 铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，2mM氯化镁的D－PBS（贮存在4℃）。配制方法如下： 70ml蒸馏水 10ml 10×D-PBS 10ml 50mM 亚铁氰化钾 10ml 50mM 铁氰化钾 0.2ml 1M 氯化镁底物/染液：染液含有1mg/ml X-gal  以下试剂即配即用： 20ml染液 1ml X-gal（20mg/ml）  步骤： 1. 用质粒pCMV·SPORT-βgal转染，使其表达24小时以上。 2. 每孔用2ml含有钙镁的D-PBS（Cat.No.14040-133）洗细胞一次。 3. 在室温用1ml固定液固定细胞5分钟。 4. 每孔用2ml D-PBS洗两次。 5. 每孔加入底物/染液溶液1ml并在室温或者37℃温育2小时至过夜。 6. 每孔加入2mlD-PBS润洗，在倒置显微镜下观察细胞，并估计蓝色细胞（β－gal－阳性）的比例。 7. 如要保存培养板，每孔中加入1ml含有10%福尔马林的PBS，室温放置10分钟。用D-PBS润洗后4℃保存在PBS中。  在转染细胞抽提物中测定β-gal表达  此实验方法用于测定细胞抽提物中β-gal活性。可以测定从96孔板到100mm培养皿转染所得的活性。此方法可适用于悬浮细胞（参见步骤2注意事项）。  溶液裂解液：0.1％ Triton X-100/0.1M Tris-HCl（pH8.0）。 450ml蒸馏水 50ml 1M Tris-HCl（pH8.0） 0.5ml Triton X-100去垢剂  100×Mg溶液 0.1M氯化镁 4.5M 2-巯基乙醇 4℃保存 0.1M磷酸钠（pH 7.5） 41ml 0.2M Na2HPO4 9ml 0.2M NaH2PO4 50ml蒸馏水 4mg/ml ONPG（o-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷）溶于含有2mM 2-巯基乙醇的0.1M磷酸钠（pH 7.5），4℃储存。 1M 碳酸钠水溶液使用GENETICIN?筛选抗生素筛选稳定转染株  筛选所需的GENETICIN抗生素的量会因细胞类型，培养基和血清成分的不同而不同。另外，如果使用粉末GENETICIN抗生素，则需要计算每批抗生素的剂量，因为效价会波动。或者使用GENETICIN抗生素溶液，其活性会为100%。  一般使用100到1100μg/ml的GENETICIN抗生素浓度筛选稳定的转染株，使用一半的筛选剂量保持培养的抗性。在转染前，使用您的细胞进行一个剂量-反应分析以确定杀死细胞的最低抗生素浓度。可以使用稍高的浓度筛选稳定的转化子。  制备储液：50mg/ml 1. 样品计算： 标记效价：700μg/mg 如配制10ml，需要500mg活性药品。因此需要的总的干重为714mg。 2. 称量714mg GENETICIN抗生素。 3. 溶于10ml蒸馏水。 4. 无菌过滤。或者，可以使用即时可用的溶液（无菌过滤），全效价为50mg/ml活性抗生素。  剂量-反应分析： 1. 制备不含青霉素或链霉素的完全培养基。 2. 加入0到22μl 50mg/ml的GENETICIN抗生素溶液（终浓度为0至1100μg/ml完全培养基，以100ug/ml梯度增加）。 3. 使用胰酶消化细胞，稀释到4000细胞/ml。 4. 在6孔板的每孔中加入100μl细胞悬浮液，每孔中已预先加入2ml含稀释GENETICIN抗生素的培养基。将培养板在湿润的5%CO2中37℃温育。每周使用含GENETICIN抗生素的新鲜培养基更换培养基两次。 5. 在10到14天，除去培养基，使用含钙离子和镁离子的D-PBS清洗细胞。使用溶于50%甲醇的0.5%亚甲基蓝染色细胞20分钟。 6. 确定杀死所有细胞的GENETICIN抗生素最低浓度。使用紧邻的稍高的浓度进行筛选。转染和筛选： 1. 使用含编码抗生素抗性基因表达序列的质粒（如pSV2neo）转染细胞。 2. 转染后第二天，将细胞传代，给细胞分裂的空间（根据细胞生长的速度，一般1:10到1:40可以达到效果）。 3. 转染后2-3天，开始使用抗生素。将转染的细胞在含抗生素的培养基中培养，抗生素的浓度由剂量-反应分析确定。含抗生素的培养基每周更换两次。 4. 10到14天后，可以观察到抗性克隆，未转染的对照应该没有细胞生长。可以根据需要固定，染色，传代或克隆抗性细胞。

10. 我准备研究某基因功能，构建了重组表达质粒（以荧光素酶为报告).现准备转染细胞，并以不含目的基因的质粒作对照。请问：  1.如果以beta-gal质粒共转染作内参，荧光素酶活性如何校正？  2.如果以beta-gal质粒共转染作内参，各种条件转染需作复孔吗？  3.各种条件转染均作复孔，结果经统计学处理，目的是排除孔间转染效率差异。是否还需要作共转染内参照？以β－gal为内参，只需将luciferase活性的值除以β－gal测的A值就行了。  复孔应该做吧，不过不需要用此来平均转染效率，因为用beta－gal就可以消除转染效率的差异。为了简便，大多数的研究者，如楼上所说，把LUCIFERASE的活性值除以beta-gal的值就行了。但理论上讲是应该将内源性的beta-Gal活性扣除的，对于哺乳细胞，内部是有此酶活性表达的。所以，要设一个孔，任何DNA都不转染，然后把所有的beta-gal活性值都减去这个阴性对照的数值，最后把这个值与LUCIFERASE的活性做比，求出的比值为LUCIFERASE基因前面PROMOTER的活性。  PROMEGA有一种试剂盒，做内参照的不用beta-gal,是另一种LUCIFERASE，用不同的底物。这种酶在细胞内没有内源性的表达，结果更可靠些。  这个beta-gal一定要加，因为它是衡量转染效率的。它可是告诉你，是十个DNA转进去了，还是一百个。如果没有这个衡量标准，转进去了一百个DNA的LUCI活性当然强，如果跟转进去十个的比高不了多少，那事实上LUCI前的PROMOTER活性还是低。如果没有这个标准就会得出错误的结论了。  减去背景beta-Gal的时候不可直接减，要换成（活性/毫克）再减，这样相当于每个细胞里减去背景。同样的道理，做比值的时候也要把A值换成（活性/毫克）再与beta-Gal比。  不知说明白了没有。总之感觉处理数据很困难。总体的趋势应该和两值直接比差别不大（在背景比较小的时候。有的细胞背景就是高）。

11. 可能你某个环节有污染，或者脂质体，或者质粒，或者培养基，最后就是你的器皿和操作。首先你要排除这些问题，你应该做对照，就是单加质粒，单加脂质体，单加培养基，最后器皿全部重新消毒。这样子观察几个小时就可以知道是哪个物质加进去后会导致细胞死掉。其次，你转染后一般4个小时就可以了，不要太长时间，还有我一个同学总结的经验是加脂质体的过程中，要每加一点就混匀一下，这样子，对细胞的损害小些。试试吧，看能否解决你的问题。首先，转染细胞用的质粒必需保证无菌，一般的质粒提取试剂盒都不能做到这一点，我们通常都会将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了，离心后，再在超净台打开，用无菌水之类溶了，这应该是最常见的做法了。其次，现在一般脂质体如lipo2000都是建议带血清转的，毒性很小，大多数转染导致的毒性都是提质粒带的大肠杆菌裂解出来的内毒素，者这对原代细胞会产生很大的影响，而你提到的MDA-MB-231,Bcap-37,MCF-7三个都是细胞系，对内毒素不敏感，我转MCF-7随便用哪个盒子都能活的很好。现在也有不少公司，比如Qiagen，天为时代，卖的试剂盒都是去内毒素的，这样的试剂盒对转原代比较好。阳离子脂质体与DNA的量之间的比例非常重要。对于一定量的DNA而言，所用的脂质体的量在一个范围之内，脂质体用量过多或过少都会降低转染效率。一般公司会给出其脂质体的优化使用方案。我用invitrogin公司的lipofectmine（2mg/ml）转染gfp质粒，293细胞，DNA：脂质体为100-150ng：1ul时效率最高。

12. MTT检测的是细胞的活性,即活细胞数的相对量,不可能用来检测转染效率.MTT检测最后细胞都碎裂,如何继续培养.可做三个平行孔,分别24.48 72小时检测. 想做Western和，RT-PCR和流式的话，如果这些孔转染相同的质粒,当然可从其中几个孔的细胞做Western,再取另外几个孔的细胞作 RT-PCR，再取别的孔的细胞作流式？其实瞬转质粒的效果都不好,建议还是做稳定表达. 1.不同的细胞及转染试剂对于质粒和脂质体的比例要求是不同的，所以在正式实验前必须摸索一个最佳转染比例。总的来说，细胞系较原代好转，脂质体的用量以说明书为参考上下浮动。 2.对于转染后的效应检测，体外直接合成的SiRNA多半在48h检测，也有72H的，但时间再长有可能降解而失去功效。对于用U6或H1质粒载体体内转录生成siRNA的，因为有一个转录时间，所以检测可以稍靠后；而且，与体外合成的相比，虽然载体也不能大量整合到细胞基因组中，但毕竟不会马上降解，Knockdown的时间效应相对要长，一般一周左右没有问题。所以可以在检测时做一个时间梯度，使实验数据更加丰满完善一些。（但要考虑靶细胞生长特性，疯长的可能效果较差）

13. 本人想作质粒转染到帖壁细胞中，有以下细节想请教一下：１质粒如何提取才到达到要求？ ２摸索G418的工作浓度时用多少孔的板较好？ ３转染的KIT用国产的行否？４现在手头上有pcDNA3和pEGFPN1(C1)，我用哪一种好呢（实验目的：转的基因抑制和增强原细胞中的内源基因的表达）？５若用pEGFP，考虑到GFP可能会影响到目的基因的活性，所以想只表达目的基因（采用的方法就是在目的基因后带终止子），如此可行吗？６G418筛选后应该有单克隆出现，如何将此克隆挑出来扩大培养？ ７如何确定目的基因已转入成功呢（细胞中原来就有这种基因）？？？？ 1一般来讲，如果你的质粒分子量不是很大（小于10K,维特洁的超纯试剂盒提取的质粒就可以用来做转染的。 2 至于G418的浓度，我认为你首先自己查查你所用的转染细胞适合的筛选浓度是多少，不一定用孔板来筛选的。 3 我认为转染KIT组好还是质量好些的为妥。当然也不是完全这样，不用KIT，用普通磷酸钙转染也会得到很好效果的，呵呵 4 如果这样的话，那你就同时构建2个载体好了呵，做个对照嘛， 5对于筛选的单克隆挑选，园子里有帖子的，你可以搜一下的，当然其它的应该也会有的，你搜一下会有很大帮助的。以前做了六年的转染（用lipofectamine)，没碰到什么问题。现在到另一个实验室工作，改用lipofectamine2000，做了两个月的转染，没得到一点结果，而且不知错在什么地方。恳请大家指点，为我指点迷津。我的实验操作 ： 1 细胞在12孔板长至90%满底时进行转染。 2 lipofectamine2000 3ul 稀释于100ul RPMI-1640中 3 质粒1ug（pcDNA3.1等）稀释于100ul RPMI-1640中 4 混匀2和3。估计混匀前 lipofectamine2000 在1640静置了5至10分钟，因为有多组质粒需要转染 5 2和3的混合物室温静置20min 6 转染前细胞用1640洗一次后，再加入600ul 1640覆盖细胞 7 将2和3的混匀物约200ul加至细胞表面，轻轻混匀 8 4至5小时后，将培养液换为含10%血清、谷氨酰胺和抗生素的培养液 9 继续培养20小时后，把转染细胞稀释传代 10 传代24小时后加G418筛选 问题：经抗性筛选后，形成的稳定细胞克隆数极少。我想lipofectamine2000和G418加压不存在问题，因为实验室有其它同事也在用lipo2000转染相同的细胞。重组质粒也不应该存在什么问题，因为我同时做了十几个不同的质粒克隆，包括含不同的抗性基因，用这些质粒做转染结果基本上是一样的。另外我用从公司买来的pcDNA3.1及pIRESneo转染也只能得到极少的稳定克隆。我查阅了invitrogen公司的protocol，上面说RPMI来转染会降低转染效率，但我同事也是用它来转染的。我和我同事操做唯一不一样的地方可能是他们是用很高级的试剂盒来提取质粒（无内毒素活性，专用于细胞转染），而我用的是GIBCO的concert rapid kit，我感觉质粒纯度也应该是很不错的，比国内的试剂盒要好很多倍。这个试剂盒的质粒最后是用TE来洗脱的。 invitrogen公司的protocol上说TE也会性降低转染效率，但我以前用手工提的质粒做转染效果也很好啊。真是无法理解。

14. ！一般来讲，转染用的质粒要求是比较高的，这只是针对于纯度来说的，用土的方法抽提的质粒当然可以做，试剂盒本身也是溶液1，2,3的优化。只是手工方法提取的话，最好做一下酚氯仿抽提和PEG纯化，而且在这个过程中用水（包括试剂配制，溶解DNA等）都要用超纯水，目的就是去除内毒素的影响。 2 不管社么时候做转染，放在-20度保存是比较安全的，建议使用 3 具体到转染目的不同，对质粒的要求也不一样，有的质粒能编码荧光蛋白，可通过荧光检测，也就是所说的报告基因质粒，有的具有真核生物可接受的抗生素抗性，比如neo抗性，真核生物中可以通过G418进行筛选。其它的没什么不同的 4 说到转染，提醒一句：转染试剂和质粒的比例一定要适当，如果需要抗生素筛选的话，最好提前做一个剂量-致死反应，寻找最佳抗生素筛选浓度。

15. 有这种可能性。 1.是不是你转染时，脂质体和DNA/RNA的混匀物加入后没有立即轻微振荡混匀？脂质体和DNA/RNA的混匀物只在孔的一处堆积造成的。 2.你加液时，枪吹打的太用劲了？最好让脂质体和DNA/RNA的混匀物一滴滴的滴下来。 3.板子本生就是有突出和凹陷的，不过常见于中心或者边缘出现特异性的大片死亡。 或许有以下可能性其实并非该细胞死亡（当然脱落后的细胞命运不佳），而是细胞本身贴壁性差，加完DNA－转染试剂后，晃动培养板混匀，加上来回转移六孔板等等物理因素导致月牙状细胞脱落细胞脱落时常为月牙状 我养的Phoniex细胞经常如此 推荐解决方法： Poly－D－lysine包被板培养板

16. 不同的转染试剂，不同的转染方法对不同的细胞的毒性都是不一致的，就像磷酸钙转染法最293t细胞毫无损伤，而且转染效率还奇高。而对hela 细胞转染效率几乎为0，而且毒性奇大。像公司的转染试剂盒也是针对不同细胞的。所以楼主的问题既没有说清楚你的细胞是什么，也没有说清楚你的转染方法是什么，希望你能说清楚。至于你所说的的现象，我用invitrogen lipo2000,也曾经经历过。六个小时已经足够质粒进入细胞，进行下一步的蛋白表达，所以如果你经过检测6小时换液的方法转出来的转染效率足可以满足你的实验要求，就可以6小时将混悬液换掉。

转染应用不同的方法就会有不同的效果喔。对于ｌｉｐｏ２０００，我用的是肿瘤细胞株中的口腔上皮癌那种，建议从开始种板就用新鲜无双抗有血清培养液，至于转染所需要的时间，5-6小时是常规，可以再增加或减少1-2小时，主要根据你自己当时的细胞状态和要求的转染效率而定。实际上，镜下来看，总是容易出现一些死亡细胞的。 

17. 1）“请教主任及各位大虾，稳定转染的机制是什么？”稳定转染的本质是目的基因在宿主细胞染色体上的稳定整合和稳定表达。  2）”一个表达质粒其基因是怎样整合到基因组DNA的？”表达质粒的整合机理一般是随机整合，即整合的位置没有规律，这类载体是主流，如pcDNA系列和pCI系列等等。极少数的情况下，有利用位点特异性重组酶或同源重组进行染色体定点整合的可能，但这些多局限与研究，商品化的东西几乎没见过。  3）“用G418筛选出细胞系后，用RT-PCR检测有mRNA表达，用Western总检测不到蛋白？”Western阳性对照和RT-PCR的阴性对照正常吗？如果都正常，那说明转录后和翻译机制可能有问题。检测表达还是以蛋白为主，毕竟转录以后影响最终表达量的因素还是不少的。