鸡矢藤挥发油体外抗乙型肝炎病毒作用研究
【摘要】 目的对鸡矢藤挥发油抗HBV作用进行体外抗病毒实验研究。方法采用水蒸气蒸馏法提取鸡矢藤挥发油，以HepG 2.2.15细胞为实验对象，检测鸡矢藤挥发油对HepG 2.2.15肝癌细胞株的细胞毒性。并在最大无毒浓度下观察鸡矢藤挥发油对HepG 2.2.15细胞表达HBsAg，HBeAg的影响。结果鸡矢藤挥发油在31～2 000 mg/L的浓度范围内，对HepG 2.2.15细胞有明显抑制作用，TC50为1 550 mg/L, TC0为500 mg/L。在最大无毒浓度下，鸡矢藤挥发油对HBsAg最大抑制率为72.49%，治疗指数为6.74，对HBeAg最大抑制率为23.64%。结论鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞HBsAg，HBeAg分泌有较好抑制作用。 【关键词】 鸡矢藤; 乙型肝炎病毒; HepG2.2.15细胞株; 挥发油; 乙肝表面抗原; 乙肝e抗原 鸡矢藤是茜草科(Rubiaceae)鸡矢藤属(Paederia) 多年生蔓性草质藤本植物鸡矢藤Paeder scandens (Lour.) Merri.的全株，其味甘酸，平和，是一种常用中草药[1]，广泛分布于中国、日本、韩国、越南、泰国、菲律宾、印度等，以及美国西海岸。传统中药经验表明其在黄疸、肝炎、肝脾肿大等治疗方面具有一定的作用[2，3]，其作为一种有效的抗乙肝辅助性草药，在中药中配伍很广;同时其嫩茎叶又是广东;海南一带居民喜欢吃的美味野菜[4]，具有很高的食用安全性。本实验中对鸡矢藤挥发油抗HBV作用进行了体外抗病毒的实验研究， 以期为鸡矢藤的进一步开发提供理论依据。 1 材料 1.1 鸡矢藤药粉鸡矢藤地上部分采集于广东湛江市郊，经广东医学院生化教研室黄迪南教授鉴定，为鸡矢藤Paederia scandens(Lour.)Merr。阴干，中药粉碎机粉碎并过60目筛，备用。 1.2 HepG2.2.15细胞株购于北京大学附属医院病毒研究所。 1.3 试剂高糖DMEM(Gibco公司)，新生胎牛血清(Gibco公司),G418(Gibco公司),MTT(Sigma公司)，青霉素、链霉素(碧云天公司)，胰酶消化液(碧云天公司);HBsAg检测试剂盒(ELISA法)，上海科华生物工程有限公司产品;HBeAg检测试剂盒(ELISA法)，上海科华生物工程有限公司产品。 2 方法 2.1 鸡矢藤挥发油的提取用水蒸气法提取鸡矢藤的挥发油。精密称取鸡矢藤药粉100 g，加1 500 ml三蒸水于2 000 ml烧瓶中，50℃水浴浸泡8 h。接挥发油测定器，电热套加热。微沸开始计时12 h回流。冷却后，收集测定管中水层并用1∶1(V∶V)乙醚萃取3次。测定器用乙醚洗涤两次并收集，油层另外收集。乙醚萃取液加入无水硫酸钠干燥过夜，过滤。挥掉乙醚后所得物合并油层得鸡矢藤挥发油。 2.2 HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg规律试验将HepG2.2.15细胞按照1×105/ml接种于24孔板上，设置6个平行孔，每孔加含有G418的培养基1ml,另设置6个平行孔，每孔加不含有G418的培养基1 ml。每天换一次培养液并收集上清储存于-20℃，共6 d。用ELISA法检测HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌量，以P/N值>2.1为阳性。同法重复试验并检测共3次。 2.3 MTT法检测鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞毒性试验以高糖DMEM、青霉素、链霉素、15%胎牛血清、G418浓度为380 mg/L的条件培养HepG2.2.15细胞并传代。用含有1%DMSO(V∶V)的培养基10 ml溶解50 mg鸡矢藤挥发油，配制成浓度为5g/L的储备液，4℃下保存。用时取出用培养基稀释成2 000，1 000，500，250，125，62，31，15 mg/L等8个浓度梯度。将处于对数生长期的HepG2.2.15细胞以1×105/ml接种于96孔板，细胞贴壁后更换含有不同浓度挥发油的培养基100 μl。并设置只用含1%DMSO培养基培养的对照孔，含1%DMSO培养基而无细胞的空白孔，每组均设定6个平行孔。继续分别培养24，48，72 h后吸尽培养液，每孔更换为含有0.5 g/L的MTT培养液100 μl,37℃下培养4h后吸尽培养液，每孔加入100 μl DMSO，孵育20 min，充分振荡溶解结晶紫。然后在490 nm波长与570 nm参考波长下测定各孔的OD值，根据各孔OD值求出挥发油对HepG2.2.15细胞的抑制率，并通过Reed-Muench法求出鸡矢藤挥发油的(半数中毒浓度)TC50。并通过CPE法镜检下确定鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞的(最大无毒浓度)TC0。细胞抑制百分率(%)=1-给药组OD-空白组OD对照组OD-空白组OD×100%(n=6)Reed-Muench公式：TC50=Antilog(B+50-BA-B×C)(A=log>50%抑制的药物浓度，B=log<50%抑制的药物浓度，C=log稀释倍数) CPE细胞病变法，是以正常细胞无自然蜕变，不引起细胞病变的药物最低浓度作为细胞的最大无毒浓度(TC0)。见表1。表1 CPE细胞病变程度对照 2.4 鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的影响根据对HepG2.2.15细胞毒性试验的结果，以挥发油最大无毒浓度作为上限，选择最大无毒浓度倍比稀释成6个浓度梯度为：500，250，125，62，31，15 mg/L。将HepG2.2.15细胞接种于96孔板，每孔100 μl，1天后更换含有不同浓度的培养液，每个浓度设置6个平行孔。48 h后，收集上清液于-20℃保存，用HBsAg、HBeAg试剂盒检测不同浓度药物对HBsAg、HBeAg的抑制率。试验按照同样的方法重复3次。HBsAg、HBeAg抑制率(%)=(空白P/N-药物P/N)/(空白P/N)×100%(P/N:)治疗指数TI=TC50/IC50(TI>2，属于有效低毒效果;1 2.5 统计学处理用SPSS11.5软件包进行统计学处理，数据以 ±s表示，进行方差分析和t检验，P<0.05被认为有显著差异。 3 结果 3.1 鸡矢藤挥发油提取经过水蒸气法得到半固体状有特殊气味的褐黄色鸡矢藤挥发油0.23 g，得率为0.23%。 3.2 HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg规律结果显示，经过380 mg/L G418筛选过的HepG2.2.15细胞培养1 d后即开始分泌HBsAg、HBeAg，通过试剂盒检测，不含G418组1～6 d的HBsAg分泌水平均处于阳性。5 d后基本上达到高峰水平，含有G418组1～2 d内HBsAg分泌为阴性，但接近阳性。2 d后呈阳性，且分泌量随着培养时间的延长而增加。HBeAg分泌量无论是含有G418组还是不含G418组，均表现为高表达。结果见表1。表1 不同天数HepG2.2.15细胞对HBsAg、HBeAg的分泌量 3.3 鸡矢藤挥发油细胞毒性实验结果显示，鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞在较高浓度500 mg/L以上时有毒性抑制作用，而在15～500 mg/L浓度内，细胞镜检查下无明显病变，表现出一定的安全性。根据CPE检测鸡矢藤挥发油的最大无毒浓度TC0为500 mg/L。根据Reed-Muench公式计算出鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞半数致死浓度TC50为1 550 mg/L。结果见表2及图1。表2 鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞的毒性 3.4 鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的抑制结果见表3所示,鸡矢藤挥发油在最大无毒浓度范围内对HBsAg的分泌有较好的抑制作用，并呈现一定的剂量依赖关系。在最大无毒浓度下，HBsAg抑制率达到了72.49%，HBeAg的抑制率达到了23.64%，HBsAg的抑制高于HBeAg的抑制(见图2)，经Reed-Muench公式计算，HBsAg抑制的半数有效浓度IC50为230 mg/L。鸡矢藤挥发油对HBsAg的治疗指数为6.74。图1 鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞的抑制曲线表3 鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制率图2 鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制曲线 4 讨论 HepG2.2.15细胞是转染了HBV DNA的HepG2细胞，它能够长期稳定地在培养液上清中分泌HBsAg、HBeAg和HBV颗粒[5]。近年来，国内外学者多利用此细胞株进行体外抗乙肝病毒药物的筛选，并对其实际意义进行研究。从实验结果来看，该细胞株培养一天以后便可以检测到HBeAg、HBsAg的分泌,与报道一致[6],细胞分泌HBeAg的浓度较HBsAg高。往往需要培养2 d左右HBsAg浓度才能达到一个较好的筛选浓度，根据有无添加G418的实验证明，G418对HepG2.2.15细胞增殖有一定的抑制作用，是HepG2.2.15细胞株增殖缓慢原因之一。而经过G418阳性筛选过的细胞株在药物筛选实验中即使不添加G418培养一样高效率分泌HBeAg、HBsAg，并且生长速率要高于含有G418培养组，因此作为一次性使用时的药物筛选细胞，添加无G418培养基培养效果更好，缩短了细胞培养的时间。 挥发油作为一种脂溶性物质，往往需要添加助溶剂来分散在培养液中，曾见报道用5%吐温80作为助溶剂[7]，但经过本课题组的验证，0.05%～1%的吐温80均对HepG2.2.15细胞有强烈的毒性作用，而1%的DMSO对细胞无明显影响。因此采用1%DMSO作为鸡矢藤挥发油的助溶剂。 鸡矢藤挥发油中含有硫成分[8～10],是其特殊气味的主要来源。而从相对含量来看，鸡矢藤挥发油的主要成分为乙酸异戊酯(20.21%)、乙酸苯甲酯 (8.04%)、十五碳酸乙酯(6.79%)、软脂酸(6.78%)、癸酸异戊酯(5.72%);另外还有樟脑、乙酸龙脑酯、丁香酚等有药理作用的成分[11]。实验结果表明，鸡矢藤挥发油对于HepG2.2.15细胞的毒性较低，通过CPE法镜检确定最大无毒浓度为500 mg/L。在此浓度范围以内，鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌具有较好的抑制作用，并有良好的量效关系。HBsAg的抑制率远高于HBeAg的抑制率可能与HepG2.2.15细胞高分泌HBeAg，较低分泌HBsAg量有关。由于利用细胞株进行药物的体外筛选存在着一定的局限性，因此，对于上述的实验结果，有待进一步进行体内的实验加以验证。 【参考文献】 |
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