发信人: Biotechen(江米小枣?橡树?津非昔比), 信区: biology
标 题: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月28日13:56:58 星期三), 站内信件
在说我们实验室的工作之前，先撤虎皮做大旗讲讲著名的1989年的诺贝尔化学奖。上世纪80年代初，University of Colorado的Thomas Cech和Yale的Sydney Altman分别发现四膜虫第一类内含子和RNase P的RNA部分具有催化活性，从而证明了RNA不仅仅是DNA到蛋白质的信号员，而且也可以像蛋白质一样催化化学反应，并因此获得了1989年的Nobel
化学奖。一句话：RNA can do chemistry. 记得arabi学长好像说过，得诺贝尔奖的工作好像是为人们打开了一扇窗，一下子开阔了人们的视野。用catalytic RNA这个工作来诠释这句话简直再完美不过了。这个发现不仅仅改变了"酶"的定义，改变了人们对RNA的看法，更重要的是，它让生命起源问题突然变得豁然开朗："生命的起源到底是DNA还是蛋
白质呢？hoho，大概都不是，最有可能承担这一任务的是RNA。"
然而，Dr. Greenberg教育我们说，"What matters in science is not what canpossibly occur, but what actually does occur."RNA到底是不是生命的起源呢？几亿年前的事情我们很难找到直接的证据，但是，有几件事可以支持RNA为生命起源这个假说：一、如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生物；二、如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性RNA的"痕迹"；三、如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列。两件事比较难，我了解的也不多，这里就不说了。现在主要说说第三个。
30个碱基的RNA序列理论上就有10E8种，从这么多的随机序列中找出具有特定功能的序列实非易事。人们当然从最简单的事情做起。什么生物学功能最简单呢？--Binding! 如果对于任意给定的粒子（包括离子、生物小分子、寡肽、蛋白质等），如果我们都能找出一个有相当强亲和性和特异性的RNA序列，那我们就向证明"RNA起源说"迈出了一……小
步:-P 90年代初许多人用不同分子作为target筛选了和它们特异性结合的RNA分子，并把这种RNA叫做aptamer。比较著名的一个工作是90年我老板Andrew Ellington在Massachusetts General Hospital的J. Szostak实验室读博后时发的一篇Nature，它们用几种有机染料做靶分别筛选出了aptamer。紧接着，在Ellington和Szostak在92年又用相似的方法
筛选出了可以和靶分子特异性结合的单链DNA分子，从而证明了单链DNA也可以折叠成特殊的三维结构，并暗示DNA可能也会具有催化活性。事实上现在人们已经筛选出了多种具有崔化活性的DNA分子。
筛选Aptamer的方法叫做SELEX或in vitro selection，我前面的一篇帖子里有较详细的介绍，简言之，就是mixing->incubate->separation->RT->PCR->transcription这样一遍一遍地循环。但是aptamer本身并不是这么简单的事情，这里面有很多问题。比如aptamer的三维结构是什么样子？它和靶分子到底是通过什么力结合的？Kd大概在什么范围？亲和性和特异性能否和抗体-抗原作用相比？特异性是如何实现的？是不是对任何分子都能筛选出与之结合的aptamer？带负电的行不行？ ……近十几年里许多研究回答了这些问题。我就不想细说了，大体说来，aptamer和其他structural RNA一样，三维结构比较复杂，不像蛋白一样有疏水内核和亲水表面，结构比蛋白更加dynamic。在aptamer的折叠以及aptamer-ligand结合过程中，除了氢键，比较有特点的力是stacking（不仅是碱基之间，所有带有π轨道的环状平面分子之间都有可能形成stack）。一般来说平面的、氢键供体和受体多的、带正电的分子比较容易筛选出对应的aptamer，得到的aptamer亲和性也较强，但许多非平面的，带负电的分子也能筛选出对应的aptamer。Kd值从分布在pM级到uM级，比较typical的Kd在几百nM左右，基本可以和抗体-抗原作用相比了。多数aptamer特异性也较高，比如茶碱的aptamer对茶碱的亲和力是对咖啡因（比茶碱仅多一个甲基）亲和力的10,000倍。
作为aptamer的发明人之一，我老板在当老板之后做起了aptamer的应用研究。虽然我们实验室方向比较杂，但aptamer的应用还是最主要的方向。Aptamer有着很大的应用前景，现在也有不少有趣的工作。比较容易想到的是作为抗体的替代品，做一些检测和治疗上的工作。比如做我旁边的那个研究生在做aptamer芯片，用于蛋白组学研究。另外，许多和蛋白质结合的aptamer会抑制靶蛋白的活性，比如thrombin aptamer的50%抑制浓度25nM。这提示aptamer可以作为蛋白抑制剂用于治疗。我们实验室的另一个"拳头项目"就是筛选、优化、修饰（增强RNA在体内的稳定性）HIV中几种重要蛋白的aptamer，据说有一个还已经FDA approved。除了作为药物，aptamer还可以用于定向给药。我在做的工作嘛……就是筛选和特定的糖结合的抗体，因为技术上的原因，直接用糖作靶不太方便，所以我现在先用一个高度糖基化的蛋白--Mucin作靶来筛选。这个大项目的big picture还是挺宏伟的，如果我们能有很多针对各种单糖，以及各种常见结合方式的双糖
、三糖的aptamer，将很大程度上扩展现在的lectin技术。但这个项目我会做到哪里我也不清楚，因为在我们实验室每个人手头都做三个项目，如果其中的某个项目进展很慢或者实在没兴趣可以扔掉一个。其实现在做这个项目主要就是练SELEX的技术，学习一些principle。
下面介绍一下跟aptamer有关的一个比较有趣的东西，叫做Riboswitch。很多aptamer在没有ligand结合的时候是没有稳定的高级结构的，但当ligand存在时就会折叠成紧密的三级结构。于是有人把某种小分子的aptamer插在E.coli mRNA的核糖体结合位点（Ribosome binding site, RBS） 和起始密码子之间，当小分子不存在时，核糖体能顺利读过aptamer区域，翻译蛋白质；但当小分子存在时，apatmer区域紧密折叠。使得核糖体不能顺利读过，抑制了蛋白质的翻译。这是完全人工构造的翻译水平的调控模型。实际上有很多natural的riboswitch的例子，作用机理多种多样，但大多出现在5'UTR，而且都是利用小分子与mRNA上aptamer区域的相互结合改变RNA结构，从而调节翻译或转录中止。Yale的Ronald Breaker就是因为发现了这些自然的riboswitch而扬名利万，最近两年风光无限。我老板有一个rotation project，就是把ATP aptamer（可以区分ATP和ADP/AMP）构造成riboswitch，后面接上报告基因，实时反映细胞内的能荷。但好像还没人愿意做这个项目。我正在酝酿中的一个project也是利用人工riboswitch来对一些蛋白进行engineering，现在还在可行性验证阶段，呵呵。
写得比较乱哈？其实跟aptamer有关的有趣的工作还有好多，但大都属于科学家（或者说发明家）的灵光一闪，没什么主线。如果把topic扩展成"从随机核酸/肽序列库里筛选功能性序列"，那么故事就更多了。我了解的也主要是些皮毛，大家如果感兴趣的话我可以现趸现卖，呵呵，我们实验室也还有其他的方向，比如上个月几个本科生用E.coli给老板照相，并发在Nature上这件事就挺有意思。他们把cyanobacterium里感受红光的phytochrome及其下游通路中的蛋白移植到用大肠杆菌里，接上LacZ"显色"，把这样的E.coli涂在平板上，平板就成了感光发色的"胶卷"。最近老板这张E.coli版大头贴又入选了Nature的年度Gallery。也算是小风光了一把，呵呵
嗯，越写越乱了，先写到这吧。大家有什么砖尽管拍，呵呵
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※ 来源:?饮水思源 bbs.sjtu.edu.cn?[FROM: 71.145.153.204]
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发信人: Biotechen(江米小枣?橡树?津非昔比), 信区: biology
标 题: Re: 多谢版主去除乱码Re: 蒲慕明 神经所2005年?..
发信站: 饮水思源 (2005年12月12日12:59:54 星期一), 转信
SELEX=Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment 也就是in vitro selection.是一个外延比较广泛的技术，基本思想是先合成一段随机核酸序列（flanked by determined sequences），然后用某种方法将具有某种活性的核酸和不具有该活性的核酸分离开，然后扩增具有活性的核酸，用同样的方法进行下一轮筛选。根据不同的目的，进行几轮到几十轮的筛选，就能得到具有所需活性的序列。具体到转录因子这个问题，就合成几十个nt的随机序列dsDNA pool. 将这个pool和转录因子一起incubate一段时间，然后过硝酸纤维膜，不和转录因子结合的dsDNA就流过去了；和转录因子结合的dsDNA被留在膜上。然后把膜上的DNA洗脱下来，PCR，继续下一轮。当DNA pool和转录因子结合比较强的时候，就建库，测序。
呵呵，我现在正在做的就是这个东东。不过我是筛选和目标蛋白bind的ssRNA，也就是所谓的aptamer。从开学到现在做了10来个round还没什么结合活性呢:-P
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发信人: redaiyu(热带鱼), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月28日17:09:27 星期三)
顶一个，呵呵！
现在还对你们老板那个以病毒的滚轮复制机制为基础的检测方法记忆犹新，想象力不是一般的强。
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发信人: Biotechen(江米小枣?橡树?津非昔比), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日07:38:23 星期四), 转信
这个涉及到把aptamer和核酶连起来构造的allosteric-ribozyme。
我们实验室在尝试用这个方法检测靶分子，发过一篇NBT和一篇JACS，还算有趣，我晚上详细写写。
其实搞生化技术的实验室发JACS是件无足挂齿的事。JACS上净是些看起来很酷其实没什么用的新技术。就连Nature Biotech和Nature Method上也有些这种文章。不过话又说回来，和搞science一样，有时搞出一种新技术时也说不清这个技术有多重要。搞技术的另外一个郁闷之处在于，解决同一个问题往往有很多种方法，你发明出来的技术可能就比别人的技术差一点点，或者贵一点点，时间一长就会被市场的大浪淘沙给淘掉。就像DNA测序，生物系的本科生人人都知道Sanger，但知道Gilbert的人就少多了，能把化学测序法解释出来的人就更少了。现在搞超低成本快速测序的人也大有人在，但最后只要有一个人成功了，其他人的工作就都消失在历史长河中了。连得了诺贝尔奖的Gilbert都免不了被忘却，其他人就更甭说了。
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发信人: aspirin(司马不光), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日03:04:55 星期四), 站内信件
问两个问题。
第一个，aptamer是RNA，那么它会不会很容易降解掉？
这个对于它的应用是不是一个比较大的限制？
你提到的修饰能在多大程度上缓解这个问题？
第二个，怎么把aptamer连到RBS上面？
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发信人: Biotechen(江米小枣?橡树?津非昔比), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日07:06:25 星期四), 站内信件
第一个问题很重要，现在有很多人都在做这方面的工作，也有些很有趣的解决方案。
在谈解决方案之前先谈一下问题的本质。RNA本身是很稳定的东西，在体内和体外被降解RNase的作用，而RNase又偏偏普遍存在，所以才显得RNA不稳定。那么RNA是如何被降解的呢？以RNase A为例，RNase A的一个His把位于RNA切割位点5'处的核苷酸的2'-OH上的H+抢过来，使得2'-O变成一个很强的亲核试剂，2'-O再亲核进攻3'位上的P，取代掉磷酸二酯键上连着 下一个核苷酸的氧，形成2',3'-cyclic phospate（环磷酸），这样RNA链就断了。随后，RNase A再让一个水分子的O进攻2',3'环磷酸上的磷，把2'-OP键取代下来，形成2'-OH和3'-OPi
可以看出2'-OH是RNA降解的罪魁祸首。如果把2'-OH改成别的基团，RNA降解就会被缓解很多。有报道称2'-F或者2'-氨基修饰的aptamer（每个核苷酸都修饰，不是末端修饰）在血清中的半衰期长达80h，已经足够稳定了。为什么选这两种修饰呢？ 因为T7 RNA 聚合酶和AMV反转录酶可以分别以这两种修饰的核苷酸和RNA为底物进行转录和反转录，因此可以用修饰的核苷酸来进行SELEX。另外，2'位的修饰不仅增加了RNA的稳定性，而且改变了RNA参与化学反应的能力，所以利用修饰的核苷酸也许能筛选出用正常核苷酸筛选不出的功能性RNA。去年我们实验室又用进化的方法将T7 RNA聚合酶进行改造，使其能有利用2'-甲氧基修饰的核苷酸进行转录。
另外解决方案非常有趣……听好了啊:-P 生物体中的DNA或RNA都是D构型的，合成蛋白质用的氨基酸都是L构型的。对于一个靶肽，我们先用D构型的氨基酸去合成它（化学合成，所以靶肽不能太长），然后用正常的（D）DNA或RNA去筛选aptamer，得到序列以后，用L-DNA/RNA去合成aptamer。这种L-aptamer可以结正常的（L）靶肽，但不会被任何
DNase/RNase识别。实验证明将L-DNA aptamer放在血清中呆几天都观察不到降解。hoho cool吧？
第二个问题是我原文中没讲清楚，实际就是在DNA水平上把aptamer的序列插在基因的5'UTR上，在质粒上做，呵呵
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发信人: Biotechen(江米小枣?橡树?津非昔比), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日07:18:56 星期四), 转信
谢谢师兄鼓励^_^
看来我撤虎皮做大旗的策略运用得不错:-P
至于解决HIV的问题，用aptamer能不能最终奏效现在还不得而知。最主要的一个问题仍然是HIV的变异太快，我们实验室有人正在筛选不同株HIV的某个蛋白的aptamer，并且想看看有没有哪个aptamer能识别多种变异的该蛋白。另外，现在把aptamer用作药物的研究，主要是把aptamer作为细胞外蛋白的抑制剂，因为DNA/RNA跨膜还是个挺麻烦的事。另外细胞内有这么多参与RNA代谢的machinery，就算不降解你，“贴着你让你干不了活”也够你受的了。所以么……还有很长的路要走呢
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发信人: aspirin(司马不光), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日07:32:30 星期四), 站内信件
RNA容易被水解是因为2'羟基，
所以修饰是一个不错的解决方法，
但是为什么不直接用DNA呢？
呵呵，第二种解决方法确实构思非常巧妙，佩服想到这个主意的人，
可惜的是如果想推广到多肽以外的其他靶物质会比较困难。
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发信人: Biotechen(江米小枣?橡树?津非昔比), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日07:43:53 星期四), 站内信件
1, 用DNA的，很多人都在用，我们也在用。
2, 理论上任何靶分子都可以这样做，有手性的就把手性反过来，没手性的就直接筛。
其实这个方法最大的缺陷是，成本太高，呵呵
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发信人: aspirin(司马不光), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日14:10:35 星期四), 站内信件
那么再往深了问一步。
DNA加上你提到的那两种修饰，一共有三种了，
各有啥有缺点，简单说说吧。
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发信人: Biotechen(江米小枣?橡树?津非昔比), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日15:08:20 星期四), 站内信件
我还没细看过相关的原始文献，但从我现在的知识来看，要考虑这么几方面。
首先就是成本，DNA无疑是最有优势的。
第二是和抗降解程度，
具体的数据我没有，不过对于特定某种应用来说，只要达到一定的要求就可以了。
第三，修饰基团的化学性质会影响aptamer
的结构和筛选过程。比如氨基修饰就可以使RNA多了很多氢键供体，这一点就是DNA所不具备的。但是这些氢键供体到底“有没有用”恐怕不那么容易说清。另外对DNA来说，除它了缺少2'-OH以外，脱氧核糖的构象和脱氧核糖的构象也不一样（分别是C2-endo和C3-endo）。所以不同修饰的核苷酸也好，DNA也好，都是一套四个结构不同的元件。至于
哪套最好，我觉得很难说清楚，case by case，呵呵。毕竟这是个充满“随机”的过程。
为防止误解再说明一下，修饰的aptamer不是按照筛选好的常规RNA aptamer的序列，用修饰的核苷酸合成（这样aptamer的结构就变了）；而是在筛选的过程中一直使用修饰的核苷酸。因此我觉得很有可能对于不同
的靶分子，用某一种修饰的核苷酸更容易得到亲和性、特异性较强的aptamer。
P.S.
C2-endo：C2在C1, C4, O组成的平面的上方（和C5同侧），C3在此平面下方。
C3-endo：C3在上述平面上方，C2在下方。
看下面这个图就清楚了
发信人: bacbac(bac), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月29日22:32:25 星期四)
上次实验室看BOOK CHAPTER 我正好轮到一章里面简单地提到HIV，所以想问的仔细些。
变异问题大是指哪部分变异（据我所知应该在蛋白水平）？5'转录产物有个叫TAR的RNA序列以及和TAR结合的蛋白Tat变异也很大么？如果能在开始就设计aptamer把HIV的转录抑制住不是不用过多考虑后面的序列变异情况了么？（先不考虑是不是能穿核膜这些东西）
HIV的情况不太清楚，非常希望你或大伙有谁知道一些HIV的情况的化能在版上聊聊
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发信人: aspirin(司马不光), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月30日01:26:14 星期五), 转信
呵呵，我不是很了解HIV。
我觉得如果要抑制转录比较困难，
因为很难专一性抑制HIV基因，而不抑制宿主基因。
或者如果能只抑制被HIV感染的T细胞的基因转录也行，
可是这个也比较困难。
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发信人: Biotechen(江米小枣?橡树?津非昔比), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月30日02:56:40 星期五), 转信
我就知道一点点，随便说说
现在有些HIV药物是HIV反转录酶的抑制剂（比如一个叫AZT的药物），反转录酶人类是没有的，所以理论上这是一个好靶点。
但有趣的是几乎所有HIV反转录酶的抑制剂都会抑制线粒体DNA聚合酶。而且对HIV反转录酶抑制效果越强的药，对线粒体DNA聚合酶的抑制效果也越强。
这是听seminar听来的，呵呵，具体的我也不清楚
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发信人: aspirin(司马不光), 信区: biology
标 题: Re: 说说我实验室的研究：Aptamer及其他
发信站: 饮水思源 (2005年12月31日04:07:05 星期六), 转信
是这样的，我在大三上的时候听过一个现在在荷兰研究病毒的交大校友的讲座，
他特别提到了抗HIV的药对于线粒体有害，不过我不记得是逆转录酶抑制剂了，
也不记得是对线粒体DNA聚合酶有抑制作用。
当时他提出的解释就是线粒体的内共生起源，具体的我也记不清了。
