质粒DNA的提取、鉴定与转化
分子生物学综合实验
学时：18
概述
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，
送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，
携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体
（vector）。
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基
因工程的载体必须具备下列条件：（1）是一个复制子，载
体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载
体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因
在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有l到几个限制
性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；
（4）载体具有选择性的遗传标记，根据标记，从而知道目
的基因是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞
从其他细胞中分离筛选出来。由于细菌质粒具备上述条件，
因而它已成为基因工程中常用的载体之一。
载体(Vector)：
用于携带重
组DNA，并
且能够使外
源DNA一起
复制与表达
的质粒(运载
工具)。
质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传
因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些
动植物细胞中，在细菌细胞中最多。质粒具有自主复制性、不相容性、多
拷贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切
酶单一识别位点等特点。它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染
色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对
宿主细胞的补偿。
1.严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下
的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细
胞中只有一份或几份拷贝；
2.松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之
下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药
物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几
千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过
氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
质粒类型：
一、实验目的：
?大肠杆菌在LB培养基上培养，用碱性裂解法快速从大
肠杆菌细胞中分离、提取、纯化质粒DNA。用紫外吸
收法测定质粒DNA含量；用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其
纯度；用质粒转化实验，检测质粒的生物活性。
?通过本实验使学生能熟练掌握质粒的提取纯化、限制性
内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳、大肠杆菌感受态细胞制
备及转化等方法和技术。
二、实验流程
细菌培养物的生长
细菌的收获和裂解
质粒DNA的纯化
质粒DNA的鉴定
大肠杆菌感受态细胞的制备
质粒DNA的转化
筛选转化子和计算转化率
？
思考和总结
三、实验准备
?1、仪器和材料
\微量加样器、无菌工作台、高压锅、低温高速离
心机等；
\1.5mL塑料离心管、枪头、培养皿（需高温灭
菌）；
\实验材料：大肠杆菌PBLGC，含抗卡那霉素基因
质粒。
?2、试剂
\LB培养基，配2000ml。成分如下：每升含有胰蛋白胨
10g，酵母提取物5g，NaCI10g，琼脂糖或琼脂（固体
培养基时用）15g，用10mol/LNaOH调pH至7．0。高
压灭菌30min。
\pH8.0GET缓冲液，配100ml。成分如下：50mmol／
L葡萄糖，10mmol／LEDTA(pH8.0)，25mmol／L
Tris－HCl(pH8.0)。高压灭菌30min。
\pH4．8乙酸钾溶液，配100ml。成分如下：60mL
5mol／LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mLH
2
O。高压灭
菌30min。
\0.lmol／LCaCl
2
溶液：每100mL溶液含CaCl
2
（无水、
分析纯）1.1g，用双蒸水配制。高压灭菌30min。
\0.2mol／LNaOH(内含1%的SDS)，注：临用时配；
\异丙醇；
\7.5mol／LNH
4
Ac；
\70％乙醇；
\pH8.0TE缓冲液：10mmol／LTris－HCI，lmmol／LEDTA，其中含
RNA酶20ug／mL。
\TBE缓冲液：称取Tris2.18g、硼酸1.1g和EDTA－Na
2
0.14g用蒸馏水
溶解后，定容至400mL，称为TBE缓冲液（0.5×TBE）；
\琼脂糖(电泳用)；
\EB染色液：将EB溶于蒸馏水或电泳缓冲液，使最终浓度达到0．5～lug
／mL。避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1000倍；
\40%蔗糖溶液；
\前沿指示剂：0.5%溴酚蓝（BPB）染色液。
四、实验内容
（一）质粒DNA的分离、纯化
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基
本步骤：
?培养细菌使质粒扩增；
?收集和裂解细菌；
?分离和纯化质粒DNA。
1、碱裂解法原理:
本实验采用
本实验采用
碱裂解法
碱裂解法
进行质粒的小量制备。十二烷基磺
进行质粒的小量制备。十二烷基磺
酸钠（
酸钠（
SDS）
）
是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂
是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂
解，又能使一些蛋白质变性。
解，又能使一些蛋白质变性。
?用
用
SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒
处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒
DNA和染色体
和染色体
DNA。
。
两种
两种
DNA在强碱环境都会变性。
在强碱环境都会变性。
?当加入
当加入
pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液
的酸性乙酸钾降低溶液
pH值后，质粒
值后，质粒
DNA将
将
迅速复性，而染色体
迅速复性，而染色体
DNA分子巨大，难以复性。
分子巨大，难以复性。
?通过离心，大部分细胞碎片、染色体
通过离心，大部分细胞碎片、染色体
DNA、
、
RNA及蛋白质
及蛋白质
沉淀（
沉淀（
SDS的作用下
的作用下
）除去，而质粒
）除去，而质粒
DNA留在上清中
留在上清中
。
。
?再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒
再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒
DNA。
。
2、实验材料、主要仪器和试剂
（1）材料：含有质粒PBLG的大肠杆菌DH5α
G
植物表达载体PBLG结构图
Bm:BamHI;H
3
:HindIII;R
1
:ECORI;SI:SalI
（2）仪器：
(1)塑料离心管架（30孔）；
(2)10、100、1000μL微量加样器；
(3)1.5mL塑料离心管（又称EPPendorf离心管）；
(4)低温高速离心机（20000r／min）一台；
(5)无菌工作台
(6)高压锅，
(7)常用玻璃仪器及滴管等。
（3）试剂：
(1)LB培养基成分如下：每升含有胰蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCI
10g，琼脂糖或琼脂（固体培养基时用）15g，用NaOH调pH至7.0。
(2)pH8.0GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol／LEDTA，25mmol／L
Tris－HCl）；
(3)0.2mol／LNaOH(内含1%的SDS)，注：临用时配；
(4)pH4．8乙酸钾溶液（60mL5mol／LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL
H
2
O）：该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol／L。
(5)异丙醇；
(6)70％乙醇；
(7）pH8.0TE缓冲液：10mmol／LTris－HCI，lmmol／LEDTA，其中
含RNA酶20ug／mL。
3、操作步骤
1．培养细菌将大肠杆菌PBLG接种在LB固体培养基上，37℃
培养12h，挑一个菌斑接种在液体LB培养基上，37℃培养12～
16h。
2．从菌落中快速提取制备质粒DNA
（1）在无菌工作台上取1.5mL菌液加入EPPendorf离心管中，转速
10000r／min，离心lmin，去掉上清液(注意，一定要吸干上清
液)。加入150μlGET缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。
注：溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须在使用时新配制溶
液。使用EDTA是为了去除细胞壁上的Ca
2+
，使溶菌酶更易与细
胞壁接触。
(2)加入200μl新配制的0.2mol／LNaOH（内含1％SDS）。加盖，
颠倒2～3次，使之混匀，冰上放置5min。
注：SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性。
(3)加入150μl冰冷的乙酸钾溶液（pH4．8）。加盖后颠倒数次使
混匀，冰上放置3-5min。
(4)用低温高速离心机，转速为10000r／min，离心5min，上清液
倒入另一干净的离心管中。
注：乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物，在冰上放置
5min是为了沉淀完全。如果上清液经离心后仍混浊，应混匀后再冷
却至0℃重新离心。
(5）另取一个Eppendorf管，转入上清，并加等体积异丙醇，混匀
，室温放置5min，12000r／min离心5min，弃去上清液。
(6)加入200μl无菌蒸馏水溶解沉淀，再加入1/2体积7．5mol
／LNH
4
Ac，混匀后冰浴3～5min，以12000r／min离心5min。
(7)转移上清至新管中，并加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙
醇，室温放置5min后以12000r／min离心30min。弃去上清。
(8)沉淀用70％乙醇洗涤一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙
醇，室温自然干燥。
(9)加入20μlTE，使DNA充分溶解，置-20℃贮存,待用。
（二）质粒DNA的含量及纯度鉴定
?含量测定：紫外吸收法
?纯度鉴定：紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳
1、实验原理：
（1）测定DNA浓度的方法有两种：
?紫外光吸收法：核酸在260nm处具有强吸收峰，所以通
过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因
为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一
般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测
定比较纯的样品。
?溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质
含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用
测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧
光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。
220240260280
0.1
0.2
0.3
0.4
波长（nm）
光
吸
收
1
2
3
天然
DNA
核苷酸总
吸收值
变性
DNA
核酸的紫外吸收特性
（λmax=260nm）
纯DNA
OD
260
/OD
280
=1.8
纯RNA
OD
260
/OD
280
=2.0
对于质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒
DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，
移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒
DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋
状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的
质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。
核酸的变性
部分双螺旋解开无规则线团链内碱基配对
在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢
键断裂，双螺旋解开，DNA的功能丧失。如高温、
pH值、变性剂(尿素、甲醛)等。
加热
DNA的变性过程
琼脂糖凝胶电泳
是一种非常简便、快速分离鉴定核酸的方法，
它是用琼脂糖或优质琼脂糖粉作为支持介质的一种
电泳分离方法。
它主要适用于≥1Kb的核酸的分离，样品DNA在
电泳过程中有电荷效应和分子筛效应，其迁移率大
小主要与DNA的分子大小和空间构象有关，另外，凝
胶浓度、电压、pH等也会影响迁移率。核酸区带观
察，是利用核酸与EB结合，在紫外光下可发出橙黄
色荧光的性质，借助于紫外观测仪来进行。
荧光染料EB染色的原理
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium
Bromide)。EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配
对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。
激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收
254nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm
和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发
射波长为590nm的可见光（红橙区）。
荧光染料EB染色的优点：
（1）染色比较简便、快捷，一般在10－15min就可反应。
（2）EB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做
到的。
（3）EB灵敏度高，可检测出10ng或更少的DNA含量。
（4）既可用于DNA也可用于RNA的检测。
（5）EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外
灯检测电泳的进程和效果。
（6）EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的EB强10倍，
因此不需洗净凝胶中游离的EB也可检测出DNA的条带。
缺点：
溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂
时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应
进行处理。
（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；
（2）室温下放置1小时，不时的摇动；
（3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。
溴乙啶在260℃分解，在标准条件下进行焚化后不会有危
险性。
2、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：质粒DNA
2、仪器：(1)稳压稳流电泳仪(2)可调微量移液器
(3)水平电泳槽（4）紫外分光光度计
(5)紫外透射仪等
3、试剂：
（1）电泳缓冲液：Tris-硼酸（1×TBE）pH8.0。
（2）加样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。
（3)溴化乙锭（EB）溶液：10mg/ml
3、实验步骤：
（1）琼脂糖凝胶
①琼脂糖凝胶的制备：
以1×TAE电泳缓冲溶液配制，浓度为0.8%。将
琼脂糖粉和TAE液于沸水浴中加热至完全溶解，待冷
却至60
0
C左右时加入EB，使EB终浓度为0.5μg/ml，
充分混匀。
②凝胶板的制备：
?胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶
带，置水平台面上。
?插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm。
?将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免气泡，
室温下凝固。
?完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳
缓冲液，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，
除去产生的气泡。
③加样：
将样品DNA溶液与加样缓冲液以5：1的体积比混合，
用可调微量移液器加样，每加完一个样品，换一个加样
头。加样量5-10μl（加样时应防止碰坏样品孔周围的
凝胶面以及穿透凝胶底部）。
④电泳：
为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强
度不应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电
压(100V)，样品一进入胶内则将电压调至5V/cm。当染
料前沿移至底边1-2mm时，电泳毕。
⑤观察记录：
关闭电源，取出胶床，在紫外检测仪下观察（254nm）
凝胶中的质粒DNA（荧光）。
（2）分光光度计法定量DNA并分析其纯度：
①取5μl提取的质粒DNA，用蒸馏水稀释至3ml。
②蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分
光光度计读数至零。
③测定DNA稀释液260nm及280nm的吸收值。
④记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:
dsDNA=50×(OD
260
)×稀释倍数
以上浓度单位为μg/ml
⑤计算OD280/OD260比值，分析自制质粒DNA纯度。
（3)结果与注意事项
①质粒DNA迁移率与凝胶的浓度、电压的关系
琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，低浓度、低电压电泳分
离效果较好。胶的浓度越低，适用于分离的DNA分子越大
，这是一个总的规律。不过浓度太低，制胶有困难，电
泳结束后将胶取出来也有困难。在低电压情况下，线性
DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。但是如果电压
增高，电泳分辨力反而下降。因为电压升高了，样品流
动速度增快，同时大分子在高速流动时，分子伸展开了
，摩擦力也增加，相对分子质量与移动速度就不一定呈
线性关系。
②质粒DNA构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
根据Aaij和Borst用琼脂糖凝胶电泳研究的结果，发现在
相对分子质量相当的情况，DNA的电泳速度次序如下：共价
闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA（本实验结果
也应如此）。但琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球
形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm一0），而同样大
小的直线双链DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前进（Rm＞
0）。由此可见，构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大
。用琼脂糖凝胶电泳可将相差一个超螺旋的DNA分开。除
DNA外，RNA同样也如此。
（三）大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
1、实验原理：
)感受态细胞(Competentcells):
)转化（transformation）：
)转化的方法：
)转化体（transformant）的筛选：
（1）感受态细胞(Competentcells):受体
细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化
学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变
化，成为能容许带有外源DNA的载体分子(如重
组质粒)通过，进入感受态细胞。
（2）转化（transformation）：是将异源
DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的
遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的
基本实验技术。
注意：转化过程所用的受体细胞一般是限制
－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶
和甲基化酶的突变株。
（3）转化的方法：
)化学的方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl
2
、
RuCl等）制备的感受态细胞，通过热击处理将载
体DNA分子导入受体细胞；
)电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态
细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入
受体细胞。
（4）转化体（transformant）的筛选：
4利用载体的选择性的遗传标记，主要用不同抗生
素基因筛选，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、
四环素、链霉素等。
4将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即
可较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子
的受体细胞。
?但是，虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板
上生长和繁殖，但此时并不能确定哪个克隆中的质粒载体含有插入片
段（目的基因）。
?重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α-互
补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、PCR以及杂交筛选的方法。
α-互补现象：在许多载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨
基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-
半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码β
－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半
乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们
各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)
能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-
gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序
列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造
成LacZ(α)基因的失活，破坏
α-互补作用，就不能产生具有
活性的酶。所以，有重组质粒的
菌落为白色，而没有重组质粒的
菌落为蓝色。
2、仪器、材料和试剂：
?仪器和材料
\仪器：略。
\材料：E．ColiDH5α，自提的PBLG质粒。
?试剂
\LB液体培养基(配制见上)
\卡那霉素储存液
\含抗菌素的LB平板培养基
\0.lMCaCl
2
溶液
3、操作步骤：
?（1）大肠杆菌感受态细胞的制备
\从新活化的E．CoilDH5a菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5mlLB液体培
养基中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：100～
1：50接种置转接于100mLLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养
液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次A600nm，至A600nm在0.4左右
时，停止培养。
\培养液在冰上冷却片刻后，取3ml分两次转入离心管中，于0～4℃，4000
r／min离心10mim。
\倒净上清培养液，用600μl冰冷的0.lmol／LCaCl
2
溶液轻轻悬浮细胞，
冰上放置15～30min。
\0～4℃，4000r／min离心10min。
\弃去上清液，加入200μl冰冷的0.lmol／LCaCl
2
溶液，小心悬浮细胞，
冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液。
\以上制备好的感受态细胞悬液可在冰上放置，24h内直接用于转化实验，
也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于Eppendorf
管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
（2）细胞转化
①按下表配制细胞转化溶液：
10100/
受体
菌对
照组
/10010
转化
组
无菌水/μL感受态细胞/μL质粒DNA/μL
NO.
②将以上各组样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水
浴中保温2min(热激)，然后迅速在冰上冷却3～5min。
③上述各管中分别加入400μLLB液体培养基，使总体积约为
0．5mL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃温浴
15min以上（欲获得更高的转化率，则此步也可振荡培养），
使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。
（3）稀释和平板培养
①取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素
LB平板培养基和不含抗菌素培养上，涂匀（如
果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再
用，不要过烫）。
②菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于
37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待
菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。
（4）检出转化体和计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如下表所示。
受体菌无抗药
性
无菌落长出有大量菌落长出受体菌对照
组
质粒进入受体
细胞并产生抗
药性
有菌落长出有大量菌落长出
转化组
结果说明含抗菌素培养
基不含抗菌素培养
基
由上表可知，转化实验组在含抗菌素培养基平皿中长出的菌落可
认为是转化体，根据此皿中的菌落数则可计算出转化体总数和转化
频率，再根据受体菌对照组不含抗菌素平皿中检出的菌落数，则可
求出转化反应液内受体菌总数，进一步计算出本实验条件下，由多
少受体菌可获得一个转化体。
计算公式如下：
转化体总数=菌落数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
转化频率=转化总数／加入质粒DNA的质量
转化体获得率=转化体总数/受体菌总数
4、思考题
为提高转化率，实验中要注意的因素有
哪些？
|
|
