无菌制剂成品密封系统完好性验证——微生物侵入试验黑龙江省食品药品监督管理局药品安全监管处谭宏宇主要内容
定义和目的适用范围试验方法结果评价贮存稳定性恶劣条件下的成品密封性验证生产中的在线检漏一、概述微生物侵入试验是对
最终灭菌容器的密封件系统完好性的挑战性试验。目的是考察并确认容器密封系统的完好性。二、适用范围本验证适用于无菌
制剂生产中使用的输液瓶、西林瓶等需用多组件完成密封的容器完好性测试。三、试验方法在验证试验中，取输液瓶或西林瓶，灌入培养基，在
正常生产线上压塞、压盖灭菌。此后，将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出、培养并检查是否有微生物侵入。（一）试验样品的制备1
.在生产线上取足够量的容器，灌装SCDM/2（大豆胰蛋白胨肉汤）培养基，使用自动压塞和压盖设备将容器密封；2.将灌
装后的容器经最长灭菌程序灭菌。121℃、30′；3.取出、放冷，将每一试样倒转，使培养基与瓶口充分接触，在30～35℃
下倒置培养14天;4.选50个试样小心去除铝盖,注意不要破坏其密封口。将去铝盖时不慎损坏窗口密封性的所有试样剔除。按上述3中要求
培养样品。在培养期内，当试验中发现任何带盖试样长菌时,则试验无效,须弃去全部试样，重新从头开始试验。（二）确认培养基促菌生长能
力—营养性试验1.接种所有试样培养14天均不长菌时，随机取20个带盖试样每个试样内接种0.1ml的铜绿假单胞菌（Pseudom
onasaeruginosa）ATCC9027,菌液浓度10～100CFU/0.1ml。试验菌选择原则：（1）所选菌种的体
积大小，越小越好。（2）运动能力强。（3）适宜的培养基。2.培养在30～35℃下培养7天，或培养至所有试样都呈阳性结
果。3.判定若7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好，则容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。使用革兰染色和紫
外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质，来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。（三）挑战菌悬浮液的制备1.从铜绿假单胞菌(
Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027的新鲜斜面上取一整环培养物，分别接入含l
Oml无菌培养基的试管中，在30～35℃下培养16～18h。2.将每管的培养物分别转入含1000ml相同培养
基(SCDM／2)的容器内，于30～35℃下培养22～24h。在培养结束时，能明显见容器内培养基出现浑浊
。3.培养结束后的菌悬液即可用来作容器／密封系统完好性试验。（四）微生物侵入试验操作步骤本试验须在生物安全柜内或
其他不影响生产环境的地方进行。1.将新鲜的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027的菌悬
液倒入合适的盆中，用金属丝架固定试样容器，使试倒置在菌悬液中。2.将50个经最长灭菌程序灭菌的试样倒置，并浸入菌悬液中。该组试样
为A组。试样容器内的无菌培养基应充分接触封口内表面，样品的颈部及封口的外表面应完全浸泡在菌悬液中，见图4－54。3.同时
将25个去铝盖的试样容器倒置入菌悬液中，该组试样为B组。4.实验开始时取一份菌悬液，平板计数每毫升所含的活菌数。按2.3.
1确认试验用微生物是铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。5.将A组和B组试样容器在菌悬液中持续浸泡约
4h。6.浸泡结束时，再用平板计数菌悬液的浓度。7.从菌悬液中取出试样，擦干试样容器外残余的菌悬液，然后用含0.5％过乙酸的
70％异丙醇消毒容器外表面。8.取装满培养基有铝盖和去铝盖的样品各两个，作阳性对照。阳性对照用样品制备方法同试样，但不经菌悬液浸
泡，其外表用含0.5％过乙酸的70％异丙醇消毒。此后，接种入10～I00CFU铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugin
osa)ATCC9027，按步骤2进行培养基的营养试验。9.将消毒后的容器放在塑料袋中，置30～35℃培养7天。操作中应特别注
意不要损坏B组无铝盖试样胶塞的密封性。10.挑战试验用菌悬液经灭菌后丢弃。11.将挑战试验用的试样培养7天，观察检查试样容器内
培养基中微生物的生长情况。（1）对每一试样进行观察检查，有生长记作+，无生长计作－。（2）如果试样容器长菌，按2.3.1方法
确认生长菌是挑战微生物——铜绿假单胞菌。（3）如果所有容器都不长菌，则从浸过菌悬液的A组取10个试样，B组5个试样，分别按
2．进行培养基的营养检查。四、结果评价（一）步骤三.（二）.2、步骤三.（四）.8、步骤三.（四）.11.（3）中进行的营养
试验都合格，试样的挑战试验才有效。（二）在挑战试验开始时，挑战用菌悬液浓度(活菌数)必须达到1×106CFU/ml。（三）挑
战试验中A组和B组如有长菌，需记录长菌的试样数。在A组中如出现长菌试验，则需按下述要求作进一步调查。1.仔细去除微生物生长
的容器的盖和塞，检查容器封口是否有缺损，造成微生物侵入。2.将观察到试样容器封口的缺陷，采用拍照或及其他适当详细记录。3.如果
任何挑战试验中长菌的容器不是由于容器封口明显的物理性缺损所致，容器／密封系统挑战试验作失败论处。五、贮存稳定性1.将剩余未经过
挑战试验的容器放入箱中，保存在室温，黑暗处。2.在适当的时间间隔(如12个月、24个月、36个月等)取出一些容器，重复挑战
试验。六、恶劣条件下的成品密封性验证（一）高温高湿储存将足够量的试样倒置放入恒温恒湿仪，设定温度33～35℃，相对湿度90%
～95%，分别于7天、14天、21天、28天、42天、56天、90天各取20瓶/支，按前述三.（四）步骤进行微生物侵入试验。（二
）长途运输为考察长途运输的方式、途经环境和运输时间对容器密封性的影响，可以考虑将培养基试样随成品一同运输，返回后，按照三.（一）
.3和4的方法进行培养。在培养期内，当试验中发现任何试样长菌时，可判定长途运输对密封性产生不良影响，应查找具体原因，采取措施改进
密封系统、包装方式或运输方式，对改进后的措施反复验证，直至证明措施有效，从而保证产品质量。在培养期内，未发现试样长菌，可进行微生
物侵入试验，以进一步考察和评价运输对密封性的影响。（三）加压、减压法在进行微生物侵入试验时，可采用加压或减压装置，通过加压或减
压操作，增加菌液侵入容器的几率，在最差条件下进行验证，以证实密封件及其连接方式、索盖等设备和操作能够充分满足最差条件下的容器密封要
求。1.加压法当容器倒置于菌悬液中，对菌悬液适当加压，如容器密封性较差，按前述步骤操作后，培养结果应为阳性。2．减压法容器
正立放置于减压装置内，进行减压操作，达到规定压力后保持适当时间，在负压状态下抽入菌悬液，没过容器后逐渐恢复常压。如容器密封性较差，
按前述步骤操作后，培养结果应为阳性。七、生产中的在线检漏（一）适用范围适用于采用灭菌柜进行灭菌操作的安瓿、输液瓶或袋的无菌制
剂。（二）检漏方法1.色水法将灭菌柜腔体内抽至一定的真空，形成负压，通入色水，恢复常压，药品出箱后，逐支进行人工和机器灯
检，如药品颜色异常，则为泄露，予以剔除。中药注射剂多为浅黄色至棕红色，所以不宜选择暖色的染料调制色水，多使用蓝色等冷色调的染料调制
色水。对于颜色较深的中药注射剂也有不使用色水，而直接使用纯化水充当色水的做法，操作与前述一致，如果药品颜色变浅，则说明泄露，予以剔
除。2．抽真空法将药品倒置装入灭菌柜，灭菌后将腔体抽真空至一定程度，保持一定时间的负压，取出药品，逐支进行人工和机器
灯检，如装量减少，则说明泄露，予以剔除。（三）验证方法挑战性试验。制作一定数量的不同程度泄露的药品，如轻微泄露10%，中度泄露10%，严重泄露10%，完好70%。将全部样品编号，放入灭菌柜灭菌，采用色水法或抽真空法进行检漏，分别统计不同泄露程度药品的剔除率及总剔除率，剔除率大于1/1000的为验证失败，在线检漏方法无效。重新设计、制定检漏方法。谢谢！ |
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