基于Taqman

基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法和试剂盒

来源：广搜网 www.ggsgg.com 本站原创 公益为中国网民提供数字化信息 发布日期：2014-1-19 1:52:31

    发明人：王弢 秦勇（摘要：本发明涉及分子生物学领域，公开了基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的方法；该方法结合了ARMS 突变富集和Taqman-MGB 特异性荧光检测两种技术，利用ARMS 引物对突变靶序列进行特异性PCR 扩增，Taqman-MGB 探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-timePCR 基础上鉴定特定突变，此种方法与直接测序、芯片检测等突变检测技术比较，本发明用于检测基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速、通量高等优势。）

1. 基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）根据目的基因的突变位点设计ARMS 引物，所述ARMS 引物的上游引物或下游引物的
3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3 位核苷酸中的任一位错义突变；
（2）根据所述突变位点设计Taqman-MGB 探针，所述Taqman-MGB 探针特异识别ARMS 引
物的扩增产物正义链突变位点的Taqman 探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子；
（3）提取模版DNA，利用步骤（1）所得引物对和步骤（2）所得探针对模板DNA 进行荧光
定量PCR 检测。
2. 根据权利要求1 所述基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的方法，其特征在于：
将所述突变位点上游第1 位核苷酸中的错义突变。
3. 根据权利要求2 所述基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的方法，其特征在于：
所述步骤（1）中，所述突变位点为EGFR 基因2573 位错义突变，所述ARMS 引物为SEQ ID No ：
3 和SEQ ID No ：5 所示的核苷酸序列。
4. 根据权利要求1-3 任一项所述基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的方法，其
特征在于：所述步骤（2）中，所述Taqman-MGB 探针为SEQ ID No ：9 所示的核苷酸序列。
5. 权利要求1-4 任一项所述方法使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测目
的基因的突变位点的ARMS 引物和Taqman-MGB 探针，所述ARMS 引物的上游引物或下游引物
的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3 位核苷酸中的任一位错义突变；
所述Taqman-MGB 探针为特异识别ARMS 引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman 探
针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子。
6. 根据权利权利要求5 所述的试剂盒，其特征在于：所述ARMS 引物为SEQ ID No ：3 和
SEQ ID No ：5 所示的核苷酸序列。
7. 根据权利权利要求6 所述的试剂盒，其特征在于：所述Taqman-MGB 探针的核苷酸序
列如SEQ ID No ：9 所示。
8. 根据权利要求7 所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由PCR 缓冲液、dNTPs、引物
对、Taqman-MGB 探针、MgCl2、TaqDNA 聚合酶和模板DNA 组成，各组分反应时终浓度为：
PCR 缓冲液 终浓度0.5 ～ 2.5× ；
dNTPs 0. 1 ～ 0.75mM ；
引物对 上、下游引物终浓度分别为150 ～ 350nM ；
模板DNA 0.01 ～ 10ng/μL ；
TaqDNA 聚合酶 0.01 ～ 1.0U/μL ；
MgCl2 终浓度为1.5 ～ 3.5mM ；
Taqman-MGB 探针 终浓度为50 ～ 200nM。
9. 根据权利要求8 所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR 缓冲液、dNTPs、引物对、
Taqman-MGB 探针、MgCl2、TaqDNA 聚合酶和模板DNA 终浓度组成为：
PCR 缓冲液 终浓度1× ；
dNTPs 0.25mM ；
引物对 上、下游引物终浓度分别为250nM ；
模板DNA 0.05 ～ 1.5ng/μL ；
TaqDNA 聚合酶 0.01 ～ 1.0U/μL ；
MgCl2 终浓度为2.0 ～ 2.5mM ；
Taqman-MGB 探针 终浓度为50nM。
基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的方法和试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种基于Taqman-ARMS 技术检基因突
变位分型的方法。
背景技术
[0002] 目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法（RFLP 法）和
DNA 直接测序等。RFLP 法是将PCR 与限制性酶切相结合的方法，但是该方法存在以下缺点：
RFLP 实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管
操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA 直接测序为突变检测的金标准。该方法存在
以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA 直接测
序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC 富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精
确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。
[0003] 因此，急需开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的基因突变检测技术，
满足基因突变分型的时效性要求。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型
的方法，解决了现有技术中进行基因突变分型程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度
低等问题。
[0005] 为实现上述发明目的，技术方案为：
基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的方法，包括以下步骤：
（1）根据目的基因的突变位点设计ARMS 引物，所述ARMS 引物的上游引物或下游引物的
3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3 位核苷酸中的任一位错义突变；
（2）根据所述突变位点设计Taqman-MGB 探针，所述Taqman-MGB 探针特异识别ARMS 引
物的扩增产物正义链突变位点的Taqman 探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子；
（3）提取模版DNA，利用步骤（1）所得引物对和步骤（2）所得探针对模板DNA 进行荧光
定量PCR 检测。
[0006] 优选的，将所述突变位点上游第1 位核苷酸中的错义突变。
[0007] 优选的，所述步骤（1）中，所述突变位点为EGFR 基因2573 位错义突变，所述ARMS
引物为SEQ ID No ：3 和SEQ ID No ：5 所示的核苷酸序列。
[0008] 优选的，所述步骤（2）中，所述Taqman-MGB 探针为SEQ ID No ：9 所示的核苷酸序
列。
[0009] 本发明目的之二在于提供上述检测方法使用的试剂盒，其使用方便，灵敏度高，技
术方案为：
所述试剂盒包括检测目的基因的突变位点的ARMS 引物和Taqman-MGB 探针，所述ARMS
引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3 位核苷酸
中的任一位错义突变；
所述Taqman-MGB 探针为特异识别ARMS 引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman 探
针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子。
[0010] 优选的，所述ARMS 引物为SEQ ID No ：3 和SEQ ID No ：5 所示的核苷酸序列。
[0011] 优选的，所述Taqman-MGB 探针为SEQ ID No ：9 所示的核苷酸序列。
[0012] 优选的，所述试剂盒由PCR 缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB 探针、MgCl2、
TaqDNA 聚合酶和模板DNA 组成，各组分反应时终浓度为：
PCR 缓冲液终浓度0.5 ～ 2.5× ；
dNTPs 0.1 ～ 0.75mM ；
引物上、下游引物终浓度分别为150 ～ 350μM ；
模板DNA 0.01 ～ 10ng/μL ；
TaqDNA 聚合酶0.01 ～ 1.0U/μL ；
MgCl2 终浓度为1.5 ～ 3.5mM ；
Taqman-MGB 探针终浓度为50 ～ 200nM
优选的，所述PCR 缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB 探针、MgCl2、TaqDNA 聚合酶和模
板DNA 终浓度组成为：
PCR 缓冲液终浓度1× ；
dNTPs 0.25mM ；
引物对上、下游引物终浓度分别为250μM ；
模板DNA 0.05 ～ 1.5ng/μL ；
TaqDNA 聚合酶0.01 ～ 0.10U/μL ；
MgCl2 终浓度为2.0 ～ 2.5mM ；
荧光探针 终浓度为50nM ；
在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以作为
在一定条件下诱发DNA 合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物
扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂（即DNA 聚合酶或逆转录
酶）存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡脱
氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15~25 个核苷酸之
间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不
必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA 合成。
[0013] 引物设计遵循原则：① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物
不能形成二级结构。③ 引物长度一般在15~30 碱基之间。④ G+C 含量在40%~60% 之间。
⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4 个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续
4 个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避
开密码子的第3 位。进行引物设计的软件有Primer 5，Beacon Designer 7。
[0014] 引物合成采用的方法为亚磷酰胺三酯法，将DNA 固定在固相载体上完成DNA 链的
合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→ 5′
磷酸二酯键连接。
[0015] 在本发明中，术语“荧光探针”是指一种标记荧光信号的寡核苷酸，是人工合成，它
可以作为在一定条件下与特定DNA 相结合，在DNA 聚合酶5'-3' 外切活性的作用下，发出荧
光信号，被荧光定量PCR 仪所接受。优选的探针是标记荧光信号的单股寡脱氧核糖核苷酸。
探针的合适长度取决于该探针的设计用途，但在一般在10~25 个核苷酸之间，较短的探针
分子虽然其特异性降低，但是可以避免因DNA 序列复杂和导致的不确定性。探针必须反应
模板的准确序列。
[0016] 探针设计遵循原则：① 探针应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物
不能形成二级结构。③ 探针长度一般在10~30 碱基之间。④ G+C 含量在40%~60% 之间。
⑤ 碱基要随机分布。⑥ 探针自身不能有连续4 个碱基的互补。⑦ 探针的5' 第一个碱基
不能为G ⑧ 探针5′端加荧光发光基团。⑨ 探针3′端加荧光猝灭基团。⑩ 探针序列内
G 的含量不能比C 的含量高。进行引物设计的软件有Express 3.0。
[0017] 探针的合成方法与引物类似，只是在序列合成以后，在寡核苷酸的5' 端加上荧光
发光基团，在寡核苷酸的3' 端加上荧光猝灭基团。
[0018] 在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR 反应的混合物，它包括反应所需的缓冲
液（buffer）、dNTP 混合液、引物、荧光探针、MgCl2、Taq 酶。
[0019] 本发明中，Taqman 探针是在Real-time PCR 技术平台发展出的荧光检测技术，探
针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光
信号被淬灭基团吸收，当进行PCR 扩增时，Taq DNA 聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性
将探针酶切降解，使得报告基团和淬灭基团分离，发出荧光信号，从而达到荧光信号的积累
与PCR 产物形成完全同步。Taqman-MGB 探针是在3’端具有小沟结合分子（minor groove
binder，MGB）的Taqman 探针，提高了探针的Tm 值，缩短探针长度，便于多突变位点的同时
检测。
[0020] 扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）是基于
PCR 技术基础上发展起来的用于检测点突变或多态性的技术。ARMS 已成功应用于分析基因
多态性，包括生殖细胞突变和体细胞突变，该技术可在大量野生DNA 背景下分辨出低含量
的突变。根据PCR 扩增时使用的Taq DNA 聚合酶缺乏3’端到5’端外切酶活性，不能修正
引物3’端碱基错配，只要引物3’端与模板1 个碱基不配对，便无法扩增出特异性产物。为
了增加引物的特异性，避免引物与靶DNA 有错配时的错配延伸，可以通过在引物的3’端的
第2-3 个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错配
延伸。
[0021] Taqman-ARMS 该技术基于Real-time PCR 平台，结合ARMS 突变富集和Taqman-MGB
特异性荧光检测两种技术。利用ARMS 引物对突变靶序列进行特异性PCR 扩增，Taqman-MGB
探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-time PCR 基础上鉴定特定突变。
[0022] 本发明有益效果在于：本发明公开的基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的
方法，具有特异性强：设计的ARMS 引物只针对基因突变序列，能特异性扩增突变模板DNA ；
在ARMS 引物的3’向5’端1-4 位设计一个或者两个错配碱基，可以增加ARMS 引物的特异
性；本发明设计的Taqman-MGB 探针针对目的基因正义连的突变位点设计，特异地结合突变
模板DNA。该方法还具有灵敏度高的特点，设计的ARMS 引物只针对基因特异突变序列，能
特异性扩增突变模板DNA，从而达到对微量突变模板的富集作用，提高检测灵敏度。本发明
公开的方法检测基因突变灵敏度可以达到1%（即目的基因的突变基因DNA 模板数占野生
型DNA 模板数的1%）；而直接测序法检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基
因DNA 模板数占野生型DNA 模板数的20%）；检测过程为闭管反应，减少污染的可能性，操作
简单快速，整个PCR 反应过程只有90 分钟，而直接测序法则需要2 天的时间，而且是开管操
作，大大增加污染的可能性；结果判读明确客观，只需根据PCR 仪器上的数据即可完成对样
本基因类型的判读。利用本发明公开的方法能够实现高通量检测，可以在一个96 孔板上对
多个基因进行同时检测，达到准确结果；同时还具有安全性高，整个体系不包含有毒有害物
质，无需PCR 产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。
附图说明
[0023] 图1 为不同位置引入错义突变结果图（M ：Marker ；1 ：特异引物；2 ：突变位点上游
第1 位错义突变；3 ：突变位点上游第2 位错义突变；4 ：突变位点上游第3 位错义突变）。
[0024] 图2 为不同PCR 缓冲液结果图（M ：Marker ；0.5×、1×、1.5×、2×、2.5× 分别为
0.5 倍、1 倍、1.5 倍、2 倍和2.5 倍PCR 缓冲液）。
[0025] 图3 为不同MgCl2 浓度结果图（M ：Marker ；1.5、2.0、2.5、3.0 和3.5 分别表示MgCl2
浓度1.5mM、2.0mM、2.5 mM、3.0 mM 与3.5 mM）。
[0026] 图4 为不同dNTPs 浓度结果图（M ：Marker ；0.1、0.25、0.5 和0.75 分别表示dNTPs
浓度分别为0.1mM、0.25 mM、0.5mM 和0.75 mM）。
[0027] 图5 为不同引物浓度结果图（M ：Marker ；引物浓度分别为150nM 、250nM、300nM、
350nM 和400nM）。
[0028] 图6 为以L858R 突变DNA 为模板，在突变位点的正义链或反义链设计Taqman-MGB
探针结果图。
[0029] 图7 为Taqman-ARMS 技术的灵敏度结果图。
具体实施方式
[0030] 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明
本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做
进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0031] 实施例1
人类EGFR 基因位于基因组第7 号染色体上，EGFR 基因组DNA 的（Genebank ：
NG_007726.3），编码EGFR 基因的全长cDNA 如SEQ ID No ：1 所示。根据EGFR 基因错义突
变主要集中外显子21 上，EGFR 基因外显子21 序列如SEQ ID No ：2 所示，突变位点主要有
2573 位错义突变，即2573 位由T 变为G( 简称为L858R)。
[0032] 根据L858R 突变类型，利用Primer 5 设计ARMS 引物对，使错义突变位点位于上游
引物3’端的最后一位，并将位于突变位点上游第1、2、和3 位置引入错配突变碱基，具体引
物如表1 所示，下游引物为：5’- aaacaatacagctagtgggaaggc-3’(SEQ ID No ：3)
表1. ARMS 上游引物序列
3’端错配位置上游引物序列（5’→ 3’）
特异引物5’-tcaagatcacagattttgggcg-3’ SEQIDNo ：4
第2 位错配5’-tcaagatcacagattttggggg-3’ SEQIDNo ：5
第3 位错配5’-tcaagatcacagattttggccg-3’ SEQIDNo ：6
第4 位错配5’-tcaagatcacagattttgcgcg-3’ SEQIDNo ：7
构建L858R 的阳性质控品，具体为2573 位错义突变的阳性对照品。通过筛选L858R
突变DNA 或者人工合成L858R 突变序列，克隆到pGM-T 载体中，构建成重组质粒。然后将重
组质粒转化大肠杆菌DH5α，经测序确定为重组质粒后，提取重组质粒，经纯化后稀释，制得
阳性对照，备用。
[0033] 取稀释后的阳性对照与野生型基因组DNA 以不同比例混合，得到野生型样本（不
含有阳性对照品）、1% 突变样本( 阳性对照品与野生样本的比例为1:100)、2% 突变样本
( 阳性对照品与野生样本的比例为2:100)、5% 突变样本( 阳性对照品与野生样本的比例为
5:100)、10% 突变样本( 阳性对照品与野生样本的比例为10:100)、50% 突变样本( 阳性对照
品与野生样本的比例为50:100)、100% 突变样本（不含野生型基因组DNA），混合后使样品的
OD260/OD280 在1.8 ～ 2.0 之间，制成阳性突变样本，备用。
[0034] 利用L858R 突变类型的ARMS 引物对和制备的阳性对照为模版进行PCR 反应（在
20μL 体系中各组分的终浓度分别为1×PCR Buffer、0.25mM dNTP、2.5mM MgCl2、1U/ 反应
DNA 聚合酶、250nM 引物、30ng 模板DNA 和余量为水），PCR 反应条件为：95℃预变性5 分钟，
一个循环；40 个扩增循环，95℃变形20 秒，60℃退火并延伸40 秒；最后40℃冷却15 秒，PCR
产物进行电泳鉴定，如图1 所示。由图1 可知，突变位点上游1-3 位引入错配碱基，均可扩
增出目的条带，但是引入错配碱基的最佳位置在第1 位。 因此，SEQ ID No ：6 所示的核
苷酸序列为ARMS 上游引物效果最佳，将SEQ ID No ：6 和SEQ ID No ：3 构成的引物对扩增效
率最高，条带特异。
[0035] 实施例2
以SEQ ID No ：5 和SEQ ID No ：3 的核苷酸序列为引物，实施例1 制备的阳性对照为模
板进行PCR，PCR 反应中PCR 缓冲液浓度分别为0.5×、1×、1.5×、2× 和2.5×，其余成分
浓度相同（在20μL体系中各组分的终浓度分别为0.25mM dNTP、2.5mM MgCl2、1U/反应 DNA
聚合酶、250nM 引物、30ng 模板DNA 和余量为水）。PCR 反应条件为：95℃预变性5 分钟，一个
循环；扩增40 个循环，95℃变形20 秒，60℃退火并延伸40 秒；最后40℃冷却15 秒。PCR 扩
增产物通过电泳鉴定，结果如图2 所示。由图2 可知，在PCR 缓冲液浓度梯度为0.5×~2.5×
范围内均由扩增条带，当PCR Buffer 浓度为1× 时其结果最佳。
[0036] 实施例3
以SEQ ID No ：5 和SEQ ID No ：3 的核苷酸序列为引物和实施例1 制备的阳性对照为模
板进行MgCl2 浓度不同的PCR，其余组分条件相同（20μL 体系中各成分的终浓度为1×PCR
缓冲液、0.25mM dNTP、1U/ 反应DNA 聚合酶、250nM 引物、30ng 模板DNA，余量为水），MgCl2 浓
度分别为1.5mM、2.0mM、2.5 mM、3.0 mM 与3.5 mM。PCR 反应条件与实施例2 相同，扩增产
物进行电泳鉴定，结果如图3 所示。由图3 可知，在MgCl2 浓度在1.5mM~3.5mM 范围内均有
目的条带扩增，当MgCl2 浓度在2.0-2.5mM 时效果最佳。
[0037] 实施例4
以SEQ ID No ：5 和SEQ ID No ：3 的核苷酸序列为引物和实施例1 制备的阳性对照为模
板进行不同dNTPs 浓度的PCR 扩增，其他条件固定（20μL 体系中，各成分终浓度为1×PCR
缓冲液、2.5mM MgCl2、1U/ 反应 DNA 聚合酶、250nM 引物、30ng 模板DNA、余量为水），dNTPs 浓
度分别为0.1mM、0.25 mM、0.5mM 和0.75 mM。PCR 反应条件与实施例2 相同，扩增产物进行
电泳鉴定，结果如图4 所示。由图4 可知，在dNTPs 浓度为0.25 mM~0.75 mM 之间均有目的
产物扩增，当dNTP 浓度为0.25mM 时其结果最佳。
[0038] 实施例5
以SEQ ID No ：5 和SEQ ID No ：3 的核苷酸序列为引物和实施例1 制备的阳性对照为
模板进行不同引物浓度的PCR 扩增，其他条件固定（20μL 体系中，各成分终浓度为1×PCR
Buffer、2.5mM MgCl2、0.25mM dNTP、1U/ 反应 DNA 聚合酶、30ng 模板DNA、余量为水），引物浓
度分别为150nM、250nM、300nM、350nM 和400nM。PCR 反应条件与实施例2 相同，扩增产物进
行电泳鉴定，结果如图5 所示。由图5 可知，引物浓度在150-350nM 范围内均能扩增出目的
条带，但是当引物浓度为250nM 时其效果最佳。
[0039] 实施例6
采用Express 3.0 设计Taqman-MGB 探针，在ARMS 上游引物的正义链（识别ARMS 引物
扩增产物正义链）和反义链（识别ARMS 引物扩增产物反义链）突变位点设计Taqman-MGB 探
针，正义探针的核苷酸序列为ttgggggggccaaa（SEQ ID No ：8），反义探针的核苷酸序列为
tttggcccccccaa（SEQ ID No ：9）。
[0040] 以SEQ ID No ：5 和SEQ ID No ：3 的核苷酸序列为ARMS 引物，SEQ ID No ：8 和SEQ
ID No ：9 所示核苷酸为Taqman-MGB 探针，以制备的阳性对照为模版进行荧光定量PCR 验证
其特异性，荧光定量PCR 条件为：95℃预变性5 分钟，一个循环；40 个扩增循环，95℃变形20
秒，60℃退火并延伸40 秒；最后40℃冷却15 秒，结果如图6 所示。由图6 可知，当探针设
计在反义链突变位置上，其特异性、扩增效率最佳。因此，检测L858R 突变的优选探针的核
酸序列为tttggcccccccaa（SEQ ID No ：9）
实施例7
采用L858R 位点进行实验，将实施例1 制备的1% 突变样本、2% 突变样本、5% 突变样本、
10% 突变样本、50% 突变样本、100% 突变样本为模版，以实施例2 使用的ARMS 引物对为引物
和反义链Taqman-MGB 探针进行荧光定量PCR 验证其灵敏度，结果如图7 所示。由图7 可知，
本发明公开的检测方法的检测灵敏度可以达到1%。
[0041] 实施例8
取400 例自愿者的新鲜血液，提取DNA 作为模板，用Taqman-ARMS 技术检测L858R 突
变分型，引物为SEQ ID No ：5 和SEQ ID No ：3 的核苷酸序列，探针的核苷酸序列如SEQ ID
No ：9 所示，其余条件与实施例2 相同。同时将此检测方法与直接测序比较。检测结果显
示：Taqman-ARMS 检测400 例新鲜血液中，检测出16 例样本检测有突变分型，实际测序有
15 例突变，测序为突变的15 例样本中Taqman-ARMS 检测也为突变分型。因此Taqman-ARMS
检测成功率为100%，阳性检测出率为100%，两种方法检测一致率为95%。从检测结果分析，
Taqman-ARMS 技术检测突变的准确灵敏度超过测序。
[0042] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参
照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可
以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发
明。
<110> 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司
<120> 基于Taqman-ARMS 技术检测基因突变分型的方法和试剂盒
<130>
<160> 9
<210> 1
<211> 3633
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）EGFR 基因CDS
<400> 1
atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60
gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120
ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180
gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240
accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300
ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360
gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420
caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480
agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540
cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600
ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660
gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720
acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780
aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840
cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg 900
gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960
gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata 1020
ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080
aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140
ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200
atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260
gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320
gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380
gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440
tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500
gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560
agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620
cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680
CN 102776291 A 序 列 表
10
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gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740
cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800
ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860
catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920
cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980
gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg 2040
aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100
caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160
ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220
cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 2280
gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc 2340
tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac 2400
tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag 2460
atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc 2520
aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa 2580
ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg 2640
atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac 2700
ggggtgaccg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc 2760
agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc 2820
atcgatgtct acatgatcat ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag 2880
ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc 2940
attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc 3000
ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 3060
cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca 3120
accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc 3180
aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac 3240
agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300
cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc 3360
agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac 3420
actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa 3480
ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa 3540
gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc 3600
gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga 3633
<210> 2
<211> 156
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）EGFR 基因第21 外显子
<400> 2
CN 102776291 A 序 列 表
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ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc caggaacgta 60
ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggctggccaa actgctgggt 120
gcggaagaga aagaatacca tgcagaagga ggcaaa 156
<210> 3
<211> 24
<212> 人工序列
<213> 检测L858R 下游引物
<400> 3
aaacaataca gctagtggga aggc 24
<210> 4
<211> 22
<212> 人工序列
<213> 特异上游引物
<400> 4
tcaagatcac agattttggg cg 22
<210> 5
<211> 22
<212> 人工序列
<213> 第2 位错配上游引物
<400> 5
tcaagatcac agattttggggg 22
<210> 6
<211> 22
<212> 人工序列
<213> 第3 位错配上游引物
<400> 6
tcaagatcac agattttggccg 22
<210> 7
<211> 22
<212> 人工序列
<213> 第4 位错配上游引物
<400> 7
tcaagatcac agattttgcg cg 22
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12
4/4 页
<210> 8
<211> 14
<212> 人工序列
<213> 正义探针
<400> 8
ttgggggggc caaa 14
<210> 9
<211> 14
<212> 人工序列
<213> 反义探针
<400> 9
tttggccccc ccaa 14
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发明人：王弢 秦勇     电话:

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