家犬是人类最亲密的伙伴和朋友,也是人类第一个驯化的家养动物,有关家犬的起源、进化和品种形成等问题一直是各国学者研究的热点之一,关于家犬的起源问题,目前已基本达成共识,即世界范围内的所有家犬都起源于灰狼。但是,关于家犬的起源地和具体起源时间研究结果并不一致,仍然存在较大的分歧。那么对目前世界上现存的古老犬种进行分析将是揭示家犬发源地和起源时间的有效方法。藏獒是目前世界上最古老、最凶猛的大型家犬品种之一,因此藏獒起源以及与其它家犬品种系统发育关系的研究对于揭示家犬的起源、起源时间和起源地点都具有重要意义。但是目前藏獒的研究工作比较滞后,关于藏獒的起源、分类地位,以及与其它大型家犬品种间关系的研究报道较少。为了揭示藏獒的起源以及与其它家犬品种间的系统发育关系,我们测定了藏獒线粒体基因组全序列,分析了藏獒线粒体基因组的基因组成、特征,以及与犬属物种(家犬、灰狼和郊狼等)和哺乳动物的差异;利用线粒体基因组12个编码蛋白基因、COI基因、DNA条形码、控制区和高变区I序列分析了藏獒的起源、分类地位以及与其它家犬品种间的系统发育关系,推测藏獒和家犬的起源时间;测定了藏獒群体控制区序列,利用控制区和538bp高变区I序列分析了藏獒群体的遗传多样性。具体结果如下：
(1)藏獒线粒体基因组全序列测定与分析
通过克隆测序和序列拼接首次获得了藏獒线粒体基因组全序列(GenBank序列号为HM048871),发现藏獒线粒体基因组全长16710bp,包括13个编码蛋白基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个非编码区(即D-loop区),基因组成、排列方式和位置均与哺乳动物其他物种基本一致。藏獒线粒体基因组序列中T、C、A、G等4种碱基含量分别为28.7%、25.6%、31.6%和14.1%,其中AT含量(60.3%)明显高于GC含量(39.7%)。藏獒线粒体基因组13个编码蛋白基因序列长度为11410bp,其中序列最长的基因为ND5
(1821bp),最短的为ATPase8(204bp);共发现4种起始密码子,大多数编码蛋白基因(8个)均以ATG为起始密码子,ND2、ND3和ND5基因以ATA为起始密码子,ND6基因以AAT为起始密码子,而ND4L基因以GTG为起始密码子;11个编码蛋白基因的终止密码子为TAA,其中4个基因为不完全终止密码子,而CytB基因和ND2基因的终止密码子分别为AGA和TAG。藏獒线粒体基因组D-loop区序列全长为1250bp,定位在tRNA-Pro与tRNA-Phe之间,包括2个保守序列模块即CSBⅠ和CSBⅡ,而在2个保守序列模块之间有一个短片段重复区,这个重复区是由一个包含10个核苷酸构成的重复单元5
-GTACACG T(G/A) C-3
经过30个重复形成的。藏獒线粒体22个tRNA基因序列长度在66-75bp之间,总长度为1521bp,与引物源序列(家犬,GenBank序列号：U96639)
tRNA的同源性为为99.08%,共有4个变异位点。藏獒线粒体12s rRNA和16s
rRNA基因全长分别为954bp、1580bp,与与引物源序列的同源性为99.96%,仅发现1个变异位点,即在16s
rRNA基因nt372位点发生了A/G转换。 (2)藏獒的起源及与其它家犬品种的系统发育分析
采用NJ法、MP法和网络法,分别根据线粒体基因组H链12个编码蛋白基因、COI基因、DNA条形码(648bp)、控制区和控制区582bp高变区Ⅰ等5种序列,结合我们测定的和GenBank中收录的家犬、灰狼和郊狼的相应序列,以郊狼为外类群,构建了藏獒、家犬品种和灰狼的系统发育树和单倍型网络关系图,系统发育树和网络关系图均显示：藏獒、家犬品种与灰狼聚在一起,而外类群郊狼单独聚为一类,说明藏獒和其它家犬一样起源于灰狼;且藏獒与家犬品种间线粒体基因组5种序列的序列差异均小于藏獒与灰狼间的,而大于家犬品种间的,认为藏獒是家犬亚种中的一个品种,在动物分类地位上应该隶属于食肉目(Carnivora)、犬科(Canidae)、犬属(Canis)、狼种(Canis
lupus)、家犬亚种(Canis lupus
familiaris)。藏獒、家犬品种聚为4个分支,说明家犬至少有4个母系起源,与前人的研究结果基本一致;藏獒和部分的大型家犬品种如圣伯纳犬、英国老式牧羊犬等属于分支A,且藏獒与圣伯纳犬、英国老式牧羊犬等大型家犬品种间的5种序列的序列差异、遗传距离均最小,说明藏獒与圣伯纳犬、英国老式牧羊犬等大型家犬品种间的亲缘关系较近,从分子水平上证实了圣伯纳犬、英国老式牧羊犬等大型犬在品种形成过程中可能掺入了藏獒的血统。
利用Savolainen等(2002)的方法,线粒体基因组H链12个编码蛋白基因、COI基因、控制区和控制区582bp高变区Ⅰ的碱基替换率估计藏獒、家犬不同分支与灰狼间的分化时间。结果发现：综合考虑4个分支,家犬与灰狼间的分化时间分别为16000
YBP、32000 YBP、65000 YBP和50000 YBP,我们估计的家犬起源时间界于目前研究的最早的家犬起源时间(100000
YBP)和最晚的家犬起源时间(15000
YBP)之间,综合各种因素,我们认为家犬的起源时间至少在16000YBP,与Savolainen等(2002)、Pang等(2009)估计的家犬起源时间(分别为15000YBP、16300YBP)一致,也符合根据化石推测的起源时间(26000
YBP)：藏獒的起源时间分别为18000 YBP、33000 YBP、68000 YBP和56000
YBP,均早于相应序列估计的家犬起源,且系统发育分析发现藏獒与一些古老的家犬品种(如英国老式牧羊犬等)聚为一类,序列差异和遗传距离均较小,与英国老式牧羊犬共享DNA条形码单倍型,说明藏獒是目前世界上最古老的家犬品种之一
(3)藏獒群体遗传多样性分析
通过克隆测序获得了40个藏獒个体线粒体基因组控制区全序列,对藏獒控制区的结构、控制区和538bp高变区Ⅰ序列的遗传多样性进行了分析,并与犬属7个群体(金毛寻回猎犬、拉布拉多猎犬、伊利里亚牧羊犬、土耳其牧羊犬、中国灰狼、欧洲灰狼、郊狼)进行了比较。结果显示：藏獒群体控制区全序列的长度从1240bp到1320bp不等,其中主要的长度类型为1270bp(32.5%,13/40),进一步分析发现藏獒控制区全序列的长度多态性主要是由重复单元数量的不同引起的;在40个藏獒的控制区全序列中共检测到75个变异位点,多态位点百分率为5.68%,其中单一多态位点14个,占多态位点总数的18.67%,简约信息多态位点61个,占多态位点总数的81.33%;核苷酸变异类型中只有转换、插入/缺失,没有颠换出现,表现出高度的转换偏爱性;藏獒控制区全序列的单倍型多样度(H)为0.990,核苷酸多样度(pi)为1.201,平均核苷酸差异数目(k)为13.082,均高于拉布拉多犬和金毛寻回猎犬群体,但与哺乳动物其他物种相比,核苷酸多样度偏低。
在犬属8群体中,野生群体(中国灰狼、欧洲灰狼和郊狼)线粒体控制区538bp高变区Ⅰ序列的单倍型多样度(H)、核苷酸多样度和平均核苷酸差异数目均明显高于5个家犬品种;在5个家犬品种内,土耳其牧羊犬的多态位点最多为21个(3.90%)、其次是藏獒和伊利里亚牧羊犬,发现了19个多态位点(3.53%);家犬品种289个个体共检测到36个单倍型,其中29个单倍型为相应品种特有,有7个共享单倍型;藏獒的单倍型多样性最丰富,单倍型多样度为0.854,而金毛寻回猎犬的单倍型多样性最贫乏,单倍型多样度为0.471;但是,藏獒的核苷酸多样度和平均核苷酸差异数目最小,分别为0.845和4.519,伊利里亚牧羊犬的核苷酸多样度最丰富(1.427)、平均核苷酸差异数目最大(7.661)。藏獒群体的单倍型多样度比较高而核苷酸多样度较低,表明现存的藏獒群体可能是由一个较小的有效种群迅速增长形成的。总体来看,藏獒群体的遗传多样性相对贫乏。……
