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项方1贺西军2 李坤庭3张毅4 刘健2 1.河北省昌黎县畜牧发展局 066600 2.日照畜牧开发服务站 276800 3.齐鲁动物保健品有限公司 250100 4.中国动物卫生与流行病学中心 266032 猪圆环病毒病是公认的免疫抑制病之一，造成猪场损失惨重，疫苗免疫成了救命的稻草。从2011年猪圆环疫苗上市至今，已有17家圆环产品先后上市，目前，出现严重供大于求的现象，同时，养殖场也面临着幸福的烦恼，大量产品的上市，产品价格可能下降，但是，面对玲琅满目的产品，如何选择疫苗成了养殖场一个重要的课题，针对这些烦恼，本文希望能够为养殖场选择疫苗带来帮助，避免走弯路，为养殖场服务。 1.PCV-2国内外最新流行动态 由PCV-2引发的疾病已成全球流行之势，在加拿大首次报道该病原引起PMWS后[1]，学者通过调查本国包括SPF猪、部分散养猪以及育肥猪发现，猪群中PCV-2血清中抗体普遍存在，但目前该病在加拿大仍然只是散发。在英国和北爱尔兰，猪群血清中PCV-2抗体阳性率分别为86％和92％。美国、法国、丹麦、意大利、西班牙、荷兰、新西兰、日本、韩国、墨西哥等国家也相继报道猪群中存在PMWS。在我国猪群中PCV-2感染情况也不容乐观。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22个猪群采集了559份血清，用ELISA方法检测PCV-2抗体，其阳性率高达5l％，表明我国猪群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法对我国北京、山东、河北、深圳、山西、天津、广东等省(市)的12个规模化猪场发病猪群进行猪圆环病毒2型感染的流行病学调查，结果表明猪圆环病毒2型感染情况在我国猪群中相当严重。李超等[4]在2010年对安徽省PCV-2流行病学调查，结果表明安徽省14个市(县)的PCV-2抗体阳性率平均为74.36％，表明安徽省猪群中普遍存在着PCV-2的感染。从上述报道表明PCV-2在我国猪群中广泛存在。根据流行病学调查显示，虽然猪群中PCV-2抗体阳性率较高，但很大比例的抗体阳性猪群并不表现出临床症状。PCV-2与其他多种病原混合感染较为严重，调查发现沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性病原与PCV-2混合感染率达到了20％[5]。陕西省PCV-2与PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陈义祥等对广西地区197份组织病料检测发现，PCV-2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占总病料数量的57.73％。2003年王文军等[7]对黑龙江地区PCV-2阳性猪群的病料调查发现，蓝耳病和猪瘟的阳性率也较高。 哈尔滨兽医研究所刘长明[8]在2007年采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）对来自与黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地的健康猪群480份血清和发病猪群424份血清，抗体阳性率分别为79.2%和91.7%，表明PCV-2在猪群中感染率非常高。 山东农科院畜牧兽医研究所 2.PCV-2病毒特点
基因组内存在 11 个潜在 ORFs，即 ORF1-ORF11，其中 ORF1、5、7、10 方向相同,为顺时针方向；ORF2、3、4、6、8、9、11 方向相同，为逆时针方向 PCV-2 全长由 1768 或者 1767 个核苷酸组成，目前出现了新的 1766 个核苷酸的病例[9]。PCV2 基因型内核苷酸序列非常保守，同源核苷酸的同源性大于96%。 3．PCV-2(圆环病毒)毒株流行情况 根据对PCV-2毒株的序列分析结果，将PCV-2病毒分离株分为5个亚型(PCV-2a～PCV-2e), 鉴于PCV-2a和PCV-2e都有l768bp的基因组；因此，又把这几个基因型统称为PCV-2a，所以PCV-2a基因型包括PCV-2a、PCV-2e等型；而PCV-2b、PCV-2c和PCV-2d都有l767bp 的基因组，因此，又把这几个基因型统称为PCV-2b，所以，PCV-2b基因型包括PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d等型。随着时间推移，PCV-2基因型也有所变异，通过检测分析，世界范围内主要流行PCV-2亚型已从PCV-2a转化为PCV-2b(Patterson等，2010)，即PCV-2b为主要流行亚型，毒力也最强。Li等(2010)对2001-2009年间报道的136株PCV-2中国株进行了分析，结果表明PCV-2b占127株，PCV-2a占9株，其中2001年中国流行株以PCV-2a为主，以后PCV-2b占绝大部分。 2010年，西北农林科技大学张彦明[10]也得出类似结论：其对1999年～2009年NCBI中登录的556个PCV-2分离株全基因序列进行分析。结果表明，1999年～2002年所登录的PCV-2的优势流行毒株为基因a型(PCV- 4.疫苗研究进展 目前国内外学者对 PCV-2 疫苗的研究主要是从灭活疫苗、构建嵌合病毒、亚单位疫 苗、重组腺病毒基因工程疫苗以及核酸疫苗等方面进行研究。现在取得新兽药证书的有20家，其中包括外企4家，但在中国注册仅有1家，为勃林格，国内企业有文号的有10家，马上上市的也有10家。合法上市的17家圆环疫苗，不包括通过其它渠道进入中国市场的梅里亚、英特威/先灵葆雅、富道/硕腾3家及易邦的中试产品。这21家圆环病毒疫苗产品表现以下特点： 按生产方式可分：基因工程疫苗和全病毒灭活疫苗 4.1 基因工程疫苗：又可分为基因工程亚单位疫苗和基因嵌合疫苗 由于圆环病毒毒力弱，全病毒培养获得高滴度病毒难度大，部分企业采用原核表达和真核表达的方式，通过蛋白纯化浓缩提高抗原水平。勃林格、英特威/先灵葆雅为昆虫杆状病毒表达的基因工程亚单位疫苗，用PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养，获得重组的PCV-2 Cap蛋白，制备亚单位疫苗。而易邦采用PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达PCV-2 Cap蛋白，制备亚单位疫苗，但是原核表达易出现包涵体，包涵体没有活性，需要进行蛋白复性来提高疫苗效果，这个也是为什么国外企业采用真核表达的原因。从工艺上讲，勃林格、英特威/先灵葆雅属于哺乳动物细胞真核表达，而易邦属于原核表达，真核表达对工艺要求是远大于原核表达系统，这和国外企业相比还是有一定差距的。富道/硕腾为PCV1-PCV2嵌合疫苗，把PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）替换PCV-1的ORF2基因（Cap蛋白），灭活制备基因嵌合体疫苗。 4.2 全病毒灭活疫苗 由于原核表达与真核表达成本高，而且表达产量有限，对于蛋白纯化要求较高，制约了产品的市场推广。所以更多的是采用全病毒灭活的方式研究疫苗，梅里亚是最早投放市场的全病毒灭活疫苗，但梅里亚圆环疫苗没有在中国注册。关于全病毒灭活疫苗最大的瓶颈在于如何获得高滴度病毒液，所以必须优化工艺，提高滴度，目前，生物制品厂家多采用微载体悬浮培养的方式来获得高滴度病毒（通过悬浮培养GMP验证的车间很少），这就能克服圆环病毒毒力弱带来活力不强的难题。 目前市场上主要还是全病毒灭活疫苗，主要毒株：SH株、LG株、DBN-SX07株、WH株、ZJ/c株之分，但从本质上讲，是没有区别的，因为圆环病毒具有致病性的只有圆环2型，而且只有1个血清型，这5个毒株均属于PCV-2b，毒株只能表明分离地点以及天然免疫原性而已，笔者在NCBI上下载了PCV-1、PCV-2a、PCV-2b等参考序列，运用MEGA 4．0进行与疫苗毒株ZJ/C株、WH株、LG株、SH株、DBN-SX07株等序列进行比对，我们清晰的发现：ZJ/C株、WH株处于同一分支；LG株、SH株处于同一分支；DBN-SX07株与LG株、SH株遗传距离更近，这个也与毒株分离早晚有一定关系，LG株、SH株疫苗2011年上市、DBN-SX07株疫苗2012年上市、ZJ/C株、WH株2013年上市，但这5个毒株均处于1个大分支，这也说明他们之间的遗传距离比较近，所以，对于圆环病毒这个产品来讲，依据毒株选择疫苗没有多少实际意义，市场宣传毒株只是炒作的噱头而已，关键还是要病毒含量的高度。
关于病毒含量，养殖场（户）老板以及技术人员一般对于此项技术参数理解较差，因为病毒含量的表示通常比较抽象，但此项技术指标也是最重要的参数，因此，这里提示各位养殖同仁注意。疫苗的免疫效果与病毒含量成正比，提高疫苗效果最好的方式之一就是增加抗原滴度。目前市场上的疫苗上市时间早晚不一，毒株各异，病毒含量差别也比较大，早期上市的产品病毒含量比较低，但最近上市的无论ZJ/c还是WH株，病毒含量都达到107.0TCID50以上，病毒含量最高的产品甚至是最低产品的63倍。对比各个毒株：病毒含量ZJ/c株＞WH株＞SH株＞LG株=DBN-SX07株。用另一种直观表示方式：ZJ/c株1头份=2头份WH株=20头份SH株=63头份LG株/DBN-SX07株。
猪圆环病毒含量比较表
目前猪圆环病毒疫苗所用佐剂主要有水包油（O/W）、油包水（W/O）、水包油包水(W/O/W)3种剂型，水包油（O/W）佐剂：又称为水质佐剂，和水的吸收性差不多，特点是比较稀。油包水（W/O）：又称为油类佐剂，特点缓释作用比较强。水包油包水(W/O/W)：又称为双相佐剂，特点介于水包油（O/W）、油包水（W/O）之间。 猪圆环病毒疫苗佐剂比较
但目前生物制品厂家基本都宣传自家的好，由于圆环病毒毒力较弱，免疫原性较差，而且病毒很难获得高滴度培养，所以在佐剂的选择就显得非常重要，无论是哪种佐剂，都具备增大抗原颗粒，提高免疫原性，缓释作用，持续刺激，延长保护期的作用。所以佐剂的选择也必须考虑到吸收性与缓释性的平衡，所以这个只是厂家宣传显示与众不同的着眼点而已。作为养殖户选择疫苗注意观察两个指标：通针性与保护期，这个两个指标就是针对佐剂吸收好、缓释强的最好诠释。 猪圆环病毒是公认的免疫抑制的重要病原，尽管毒力相对较弱，但风险很高，目前基本都是灭活疫苗。灭活疫苗就牵扯到灭活剂的问题，使用灭活剂就要考虑有无残留的问题，如果存在残留，就会出现易致癌性、过敏反应几率高、疫苗反应重等缺点。 目前的灭活剂主要有：甲醛、BEI(二乙烯亚胺)、BPL（β-丙酰内酯）三种，甲醛最大优势价格便宜，灭活彻底，缺点是易造成残留，而且灭活会损伤病毒的糖蛋白，造成免疫原性下降，BEI和BPL，不易残留，不损伤糖蛋白，不影响免疫原性，但存在不易保存、价格昂贵的缺点。目前，灭活剂的发展趋势就是使用无残留的方法发展，国外大部分产品基本转上BEI、BPL灭活剂。但综合这几种灭活剂，BPL是灭活时间最短的（2个小时就可以彻底灭活），灭活最彻底得，不易残留（37℃，2个小时彻底水解），目前，也是最炙手可热的灭活剂。 猪圆环病毒灭活剂比较
目前首免日龄主要有2周龄、3周龄、4周龄，还有免疫母猪等首免方式，由于圆环病毒最大的危害主要表现在保育猪上，也就是说需要早免疫，对于圆环的防控有很大的帮助，所以有很多企业，说明写着3周，却建议2周龄免的这种现象的出现，就是出于这个原因。 目前首免日龄主要有2周龄、3周龄、4周龄，还有免疫母猪等首免方式，由于圆环病毒最大的危害主要表现在保育猪上，也就是说早免疫，对于圆环的防控有很大的帮助。首免日龄越早，但猪日龄越小，免疫器官免疫功能低下，效果就越差，同时，由于猪日龄小，对外源病原的刺激就越敏感，造成过敏反应、疫苗应激就大很多。因此，疫苗免疫日龄对疫苗质量有着更高的要求。高质量疫苗本身必须具备三个条件：病毒含量高、疫苗纯度高、疫苗粘度小。但由于目前圆环病毒疫苗供大于求，由于竞争的关系，为了更突出自己的产品优势，有一些企业，疫苗说明写3周，却建议2周龄免的这种现象的出现，就是出于这个原因。总之，圆环疫苗的首免日龄早与疫苗质量呈正相关。 猪圆环疫苗的首免日龄与免疫次数
对于同一个产品，通常免疫次数越多，免疫效果就越好，1次免疫之后，抗体水平会逐渐上升，到达高峰之后，抗体滴度会随着时间的延长而下降，但当抗体滴度处于保护临界值附近，需要进行2次强化免疫，由于第1次免疫之后，会产生大量的Tm细胞（记忆性T细胞），能诱导产生大量的圆环病毒抗体的细胞克隆，通过第2次强化免疫，会激活Tm细胞功能，诱导大量的圆环病毒抗体的细胞克隆产生圆环病毒抗体，从而引起抗体水平比首免有更高的抗体高度。但免疫次数多，养殖场的劳动强度就大，成本就高，免疫1次成为了生物制品厂家与养殖场的追求。但如果免疫1次，那疫苗必须具备2个条件：高抗原含量、高缓释能力；这样就能够把保护性抗体持续到4月以上，育肥猪通常养殖周期在5个半月至6个月，而猪圆环病毒主要危害保育猪（一般为1月龄-2个月龄），正好在发病高峰期，圆环病毒的抗体水平处于高峰，所以会对猪圆环病毒有很好的保护作用。 目前市场上，免疫1次：勃林格、富道、ZJ/c株、WH株；免疫2次：英特威/先灵葆雅、梅里亚、LG株、SH株、DNB-SX07株。但由于圆环疫苗价格较贵、加上圆环病毒单纯发生的较少，也就是说免疫效果难以用肉眼评估，一些本来需要免疫两次的产品（主要病毒含量低）在宣传上忽悠养殖户免疫1次，主要目的让养殖场免疫1次，成本低，接受程度更容易，但是由于产品抗原含量低，抗体水平不高，维持时间较短，造成使用效果不明显，这个也是为什么有些猪场反映免疫猪圆环病毒疫苗没有效果的根本原因。当然，免疫1次，这个是圆环疫苗的发展方向，随着生产技术的发展，这个很快就会成为现实，我们欣喜的看到近期上市的国产猪圆环病毒疫苗ZJ/c株、WH株都是免疫1次（病毒含量107.0TCID50以上）。所以，疫苗的免疫次数与病毒含量有很大关系，选择疫苗一定要学会看病毒含量。 由于圆环病毒颗粒较小、毒力较弱、免疫到产生完全保护的时间较长、免疫保护持续期较短，目前上市的产品免疫保护持续期为3-4个月，免疫后产生免疫保护的时间为21-35天。虽然，现在上市的毒株很多，但结果有较大差异，主要还是因为各个厂家的病毒含量有差异造成的，我们看到病毒含量高的产品，不但免疫次数少（免疫1次），而且免疫保护期反而长（达到4个月），从这个角度也说明了，提高圆环病毒疫苗的病毒含量的重要性。 猪圆环疫苗免疫保护期与产生保护时间
综上所述：我们明确了目前中国圆环病毒的流行毒株为PCV-2b基因型，现有的疫苗也均采用与PCV-2b同源的毒株。同时我们也明确了其他影响疫苗质量的重要因素：生产工艺、病毒含量、佐剂、灭活剂等，由于猪圆环病毒只有1个血清型，所以毒株不是选择疫苗的主要依据，更多的要考虑的是病毒含量、佐剂、灭活剂等要素。通过总结我们也得知猪圆环病毒疫苗1针免疫是有条件的：病毒含量高；疫苗纯度高；疫苗粘度小。因此养殖场在选择疫苗的时候要自主选择疫苗的知识储备。 参考文献： [1]Segal6s J,DomingoM．Postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)in pigs．A review，Vet 2002，24：109-124 [2]郎洪武，张广川，吴发权，等．断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测．中国兽医科技，2000，30(3)：3-5． [3]王忠田，杨汉春，郭鑫．规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查．中国兽医杂志，2002，38(10)：3-6． [4]李超，魏建忠，李郁等．安徽省猪圆环病毒2型感染的流行病学调查．中国微生态学杂 志．2010，22(4)：330-332． [5]琚春梅，陈焕春，樊惠英，等．猪圆环病毒2型ORFl与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究．生物工程学报．2005(3)：370·374 [6]杨增岐，杨泽晓，姜艳芬等．陕西省PCV2感染的血清学调查．西北农林科技大学学报，2006，34(4)：l-3． [7]陈义祥，刘翠权，陈芳芳等．广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查．中国兽医科技，2005，35(10)：827-831．40 [8]王文军，孙刚，张加勇等．黑龙江省猪圆环病毒血清流行病调查．黑龙江畜牧兽医．2003．8(8)：37-38． [9] 郭抗抗，张彦明，张红等. 猪圆环病毒2型分离株优势基因型分析与检测. 中国预防兽医学报.2010,32(10)808-811 [10]Guo LJ, Lu YH, Wei YW, Huang LP, Liu CM: Porcine circovirus type 2 (PCV2): genetic variation and newly emerging genotypes in
猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展 |
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