 众所周知，胎儿性别识别在我国是法律禁止的。上个月还是上上个月在求助帖内见到有朋友求助鉴定胎儿性别的方法，正好我老婆也怀孕了，就X度了一下这方面的一些资料，现转载一篇此类的论文，以为未婚或者已婚未育的朋友解惑。此方法高大上，医学生可以研究一下。
摘 要 产前诊断对于预防及控制新生儿发病率具有十分重要的意义。目前,大多数的产前诊断方法对孕妇和胎儿具有潜在的损伤,所以临床医生一直在寻找新的无创性产前诊断技术。研究表明胎儿细胞存在于孕妇外周血中,但由于其数量较少,而且存在个体差异,因此很难应用于临床。最近的研究发现母体血浆或血清中存在高浓度的游离胎儿DNA。近年来,随着分子生物学技术的发展,从孕妇血浆或血清中检测胎儿DNA并应用于临床成为可能,为无创性产前诊断开辟了一种新途径。本文着重介绍游离胎儿DNA的来源、特点及在无创性产前诊断中的应用。 关键词 无创性产前诊断;胎儿DNA;孕妇血浆 产前诊断(prenataldiagnosis)是指在胎儿出生前用各种方法诊断胎儿是否患有某种遗传病或先天性疾病的一种手段,对于预防及控制新生儿发病率具有十分重要的临床意义。目前,产前诊断方法主要有羊膜穿刺术、绒膜绒毛取样、早期羊膜穿刺术、经皮脐血抽样、胎儿活组织检查、 超声波检查法。除了超声波诊断,其它方法需要进入宫腔才能取得胎儿的遗传物质,对孕妇和胎儿具有潜在的损伤性。而超声波诊断,敏感度低且准确性较差,所以临床医生们一直在寻找新的无创性产前诊断技术。 从孕妇外周血分离胎儿细胞是无创性产前诊断的关键。由于孕妇外周血中胎儿细胞数量极少,而且富集过程中还存在胎儿细胞的损失,因此利用胎儿细胞进行无创性产前诊断存在灵敏度低的缺点,使其临床应用受到限制。近年来,由于肿瘤患者血清、血浆中癌源性DNA的发现,提示人们在其他临床应用中也有发现游离DNA的可能性。根据这一提示,Lo等于1997年用常规聚合酶 链反应(PCR)在妊娠男胎的孕妇外周血浆或血清中检测到 Y染色体特异性DNA序列,从而证实了孕妇血浆中存在胎 儿DNA。这种胎儿DNA的存在为无创性产前诊断提供了可能,引起了人们广泛关注。本文就胎儿DNA的来源、提取方法、检测以及在无创性产前诊断中的应用作一评述。 1 胎儿DNA的来源 目前对于孕妇血浆中胎儿DNA的来源尚未完全阐明,一般认为有以下3种可能:(1)来源于母体血液中的胎儿造血细胞。据推测,可能是胎儿细胞通过胎盘渗漏进入母液循环,迅速被母体免疫系统破坏,胎儿细胞破裂,胎儿 DNA释放进入孕妇血浆。但母体血液中少量的完整胎儿 细胞不可能产生大量的游离胎儿DNA,且正常妊娠孕妇和非正常妊娠孕妇血液中,胎儿细胞和胎儿DNA之间没有联系,这否定了胎儿细胞是胎儿DNA的来源这一可能机制。因此,对于胎儿造血细胞是否是孕妇血浆中胎儿DNA的来源还有待证实。(2)来源于胎盘滋养层细胞。有人提出胎儿DNA可能是由胎盘滋养层细胞被破坏后直接释放至母体血液,因为在胎盘循环发育完全时,有80%的孕妇血浆中能检测到胎儿DNA,而且胎儿DNA的含量与绒毛膜促性腺激素(hCG)的浓度密切相关。此外,Lo等通过检测 阴道分娩和剖腹产分娩前后孕妇血浆中胎儿DNA的水平来研究游离胎儿DNA的清除,发现孕妇血浆中胎儿DNA的清除率很高,多数在分娩2小时后就检测不到胎儿 DNA,这进一步证实了胎儿DNA是由胎盘滋养层细胞被破 坏后直接释放至母体血液的可能。(3)来源于妇婴转运。羊水中胎儿DNA的浓度是孕妇血浆中的200倍,这种浓度梯度使得DNA分子可能通过胎盘和膜发生直接转运。 2 胎儿DNA的提取 在提取胎儿DNA之前,需要对血液进行预处理,不同的血液处理方法对孕妇血浆中游离胎儿DNA的百分含量有明显的影响。Dhallan等用甲醛预处理孕妇外周血,通过减少母体血细胞的溶解来减少游离母体DNA,从而提高孕妇外周血中游离胎儿DNA的百分含量,但这种方法受到质疑。Chiu等将孕妇外周血经EDTA抗凝之后,以 3000r?min-1 离心10min,取上清液重复离心1次,然后按 照血样DNA提取试剂盒(QIAampDNAbloodmini,Qia2 gen)说明书中血液或体液DNA的提取方案提取DNA,这 种方法是目前最为常用的提取方法。除此之外,目前用于提取胎儿DNA的方法还有煮沸法和酚/氯仿法等。 3 胎儿DNA的检测 虽然孕妇血浆中游离胎儿DNA的含量远远高于胎儿细胞,但仅占孕妇血浆中总DNA的3%～6%。在如此强大的母体DNA背景中如何检测到胎儿DNA将取决于对胎儿特异性标记物检测分析方法的敏感性和特异性。目前广泛应用于胎儿DNA的检测分析方法主要是PCR技术,近年来质谱分析法(MS)也被应用于胎儿DNA的检测。 3.1 巢式PCR技术 巢式PCR检测胎儿DNA的原理是针对某一个待测基因,设计两对特异性引物,其中一对巢居于另一对引物的扩增产物内部。即先用外侧引物进行PCR扩增,获得一定量的产物后再用另一对内引物进行扩增。由于进行了二次扩增,使PCR反应的灵敏度和特异性都得到提高。根据这一原理,Chen等对73例妊娠26周～41周的孕妇血浆中胎儿的性别决定区(SRY)基因进行检测分析,准确率为 91178%(67/73),敏感性为97137%(37/38),特异性为85171%(30/35)。因此,巢式PCR技术可用于性别鉴定, 预防性连锁遗传性疾病。 3.2 引物延伸预扩增技术 引物延伸预扩增(PEP2PCR)技术是以15个随机寡核苷酸为引物,在DNA聚合酶的作用下进行多次循环反应,使原有的基因组拷贝数放大数十倍,然后取产物进行特异性扩增,从而获得检测。这种方法首先对标本中总DNA进行扩增,增加了目的基因的拷贝数,解决了孕妇外周血中胎儿DNA量太少而不能满足常规扩增要求的最低模板量的问题,大大提高了PCR的敏感性。Chen等用显微操作技术从395例孕妇血浆中分离得到单细胞,然后用PEP2 PCR技术检测SRY基因以诊断胎儿的性别;结果153例妊 娠男胎的孕妇血样中有149例检测到SRY基因,120例妊娠女胎的孕妇血样中除1例外均没有检测到SRY基因;其敏感性为97130%,特异性为99117%,准确性为98171%。 3.3 实时荧光定量PCR技术 实时荧光定量PCR(QF2PCR)在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性等特点。目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域,是最敏感的检测孕妇血浆中胎儿DNA的方法,可在妊娠早期检测到胎儿DNA。Gal2 biati等采用这一技术对妊娠前期、中期和后期孕妇血浆 中的胎儿DNA进行了检测,准确性分别为9914%、9718%和100%。Hwa等从56名首次妊娠男胎的孕妇血浆中分离胎儿DNA,用实时荧光定量PCR检测Y染色体上的SRY基因。结果23名妊娠男胎的孕妇血浆中,20名SRY基因阳性;33名妊娠女胎的孕妇血浆中,SRY基因均为阴性。因此,实时荧光定量PCR技术用于性别鉴定具有很高的准确性,在进行无创性产前性别诊断中有重要的价值。 3.4 质谱(MS) Chan等最近对孕妇血浆中DNA的长度分布进行 了研究,发现孕妇血浆中DNA比非孕妇血浆中DNA长,此外,还发现胎儿DNA比母体DNA短,这一特征提示我们可根据两者的大小差异采取MS检测胎儿DNA。 3.5 其它 以往,母系来源的胎儿等位基因往往检测不到,Poon等利用母亲和胎儿DNA甲基化的差异,对未甲基化的等位基因进行引物扩增分析可以检测到母系来源的等位基因,对甲基化的等位基因进行扩增分析可以检测到父系来源的等位基因,冲破了胎儿DNA主要用于检测常染色体显性遗传病和来自父系的遗传性状的限制,是胎儿DNA在无创性产前诊断中的进一步应用。 4 胎儿DNA在临床诊断中的应用 4.1 遗传病 4.1.1 性连锁遗传性疾病 通过检测孕妇血浆中胎儿DNA可以准确地鉴定胎儿性别,这为进一步诊断胎儿是否 患有性连锁遗传性疾病提供了依据。目前进行无创性产前诊断胎儿性别的方法主要集中在对孕妇血浆中Y染色体特异性DNA片段的检测。Tungwiwat等运用巢式PCR 技术同时扩增Y染色体上的SRY基因和X染色体上的 ATL1基因特异性序列。15例妊娠男胎孕妇血浆中只检测 到SRY基因特异性序列,而在其余妊娠女胎孕妇血浆中只检测到ATL1基因特异性序列,敏感性和特异性均高达 100%。基于同一技术,Zhu等通过检测孕妇血浆中牙 釉蛋白基因来实现无创性产前诊断胎儿性别。Pertl等采用多重荧光PCR反应技术检测胎儿DNA的短串联重复 序列,进行无创性产前诊断胎儿性别。 4.1.2 新生儿溶血病 新生儿溶血病是由母体体内含有 针对红细胞上父源性抗原的抗体所致,严重时导致胎儿宫内死亡。Rijnders等采用实时定量PCR法检测孕妇血浆中胎儿RhD基因的类型,敏感性接近100%,特异性为 97%,可以用于新生儿溶血病的无创性产前诊断。 4.1.3 “21三体”综合征 “21三体”综合征是一种常见 的染色体病,新生儿发病率为115‰左右,可以通过对孕妇血浆中游离胎儿DNA数量的异常来诊断胎儿是否患有“21三体”综合征。Lo等用Y染色体特异性实时定量PCR检测孕妇血浆中游离胎儿DNA,发现妊娠“21三体”胎儿的孕妇血浆中有高浓度的胎儿DNA存在。Bianchi等 以 Y染色体特异性基因(DYS1)作为胎儿DNA的标记物,利用实时定量PCR法扩增DYS1基因,检测男性胎儿DNA的水平,结果发现妊娠“21三体”胎儿孕妇血浆中胎儿DNA的水平较正常胎儿高。 4.1.4 强直性肌营养不良 强直性肌营养不良(DM)是 一种常染色体显性遗传病,发病与染色体19q13上肌营养不良激酶基因(DMPK)3′非翻译区微卫星三核苷酸(CTG)重复数目的增加有关。Amicucci等以1例丈夫患DM而自身正常的妊娠妇女为研究对象,利用孕妇血浆进行胎儿DNA序列多态性分析,检测到了从父亲遗传来的肌营养不良激酶基因(DMPK)。从妊娠妇女血浆中分离胎儿DNA能在妊娠的前3个月成功诊断胎儿遗传性肌营养不良,对遗传性疾病的无创性产前诊断有重大意义。 4.1.5 其它 近来,Chiu等通过检测孕妇血浆中胎儿 DNA对β2重型地中海贫血成功进行无创性产前诊断;Fu2 charoen等用同样的方法成功检测了HbE基因。此外, 利用孕妇血浆中胎儿DNA可以成功诊断的遗传性疾病有软骨发育不良、囊性纤维病、亨廷顿病、先天性肾上腺增生等。 4.2 妊娠并发症 胎儿DNA的另外一个重要用途就是可以作为检测妊娠并发症的遗传物质。在正常妊娠孕妇血浆中的胎儿 DNA会随孕周的增加而逐渐升高,而在病理性妊娠孕妇血 浆中胎儿DNA水平会异常升高。最早用于产前诊断的妊娠并发症是先兆子痫,Lo等[31]于1999年发现先兆子痫妊娠孕妇血清中胎儿DNA浓度为正常妊娠孕妇血清中胎儿 DNA浓度的5倍,之后Zhong等[32] 证实了这一结果。Le2 vine等发现在先兆子痫的早期,胎儿DNA水平就有异 常升高,这一现象也存在于其它病理性妊娠如早产、妊娠剧吐以及有害性胎盘形成。 总之,利用孕妇血浆中的游离胎儿DNA进行产前诊断,对胎儿没有创伤性,可在孕早期做出诊断,是目前无创性产前诊断的研究热点。此项技术不仅简单快速、方便价廉,适用于临床诊断,而且由于孕妇血浆及血清中的胎儿 DNA半衰期仅数分钟,不受前次妊娠的影响,对判断本次 胎儿情况有重要价值。无创性产前诊断技术的研究具有很好的应用前景。 看完了之后是不是觉得晕了？！不过现在做DNA的地方还是挺多的，这个准确性比B超还有什么网上流传的方法准确性高太多了。生男生女，你随便猜，也有50%的准确率。 |
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