HPLC

    天麻素，别名：4-羟甲基苯基-β-D-毗喃葡萄糖甙，分子式：C13H18O7，分子量：286.28。天麻苷元，别名：4-羟基苯甲醇，亦称对羟基苯甲醇，分子式为C7H8O2，分子量为124.14。天麻素和天麻苷元的结构如图1-1（a，b）。

    天麻素和天麻苷元药理作用有：镇静、催眠、抗惊厥、镇痛作用，对缺血再灌注及脑细胞的损伤有保护作用，可以增加心脑血管血流量，降低外周血管阻力，增加动脉血管顺应性，还有增强免疫和抗遗忘抗衰老等作用。临床上用于神经衰弱、神经衰弱综合症及血管神经性头痛等症，亦可用于治疗脑外伤性综合征，眩晕症和椎一基底动脉供血不足。

    目前，国内传统中药有效成分的提取方法普遍存在提取率低、杂质清除率不高、生产周期过长、能耗高、溶剂用量大等缺点。随着中药现代化进程的不断深入，许多现代高新技术不断地被应用到中药有效成分的提取和分离，使得中药有效成分的提取更高效和简便。超声一微波协同萃取（ultrasound-microwave assisted extraction，UMAE）技术直接将超声振动与开放式微波两种作用方式相结合，充分利用超声波振动的空化作用以及微波的高能作用，实现了低温常压条件环境下，对固体样品进行快速、高效、可靠的预处理，与常规提取方法相比，超声一微波协同萃取技术具有快速、节能、节省溶剂、污染小等优点。

    本实验应用超声一微波协同萃取法提取金线莲中的天麻素和天麻苷元，采用高效液相一二极管阵列检测法（High-performance liquid chromatography-Diode Array Detector，HPLC-DAD）测定提取物中天麻素和天麻苷元的含量，药材中二者成分的含量分别为：1.430mg/g和0.562mg/g，为金线莲的药理活性研究和质量控制提供理论依据。

1、主要仪器与试剂

1.1 主要仪器

    Agilentll00型四元梯度高效液相色谱仪（美国Agilent公司）

    Agilent TC-Cls（ODS）色谱柱（5μm，4.6*250mm，美国Agilent公司）

    CW-2000超声一微波协同萃取仪（新拓微波溶样测试技术有限公司）

    DJ-l0A型倾倒式粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）

    RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）

    LXJ-IIB型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）

1.2 试剂

    天麻素（阿拉丁试剂公司，含量98%；）

    天麻苷元（阿拉丁试剂公司，含量98%；）

    金线莲全草（购自福建省同春药业有限公司，产地为广西，经福建医科大学药学院天然药物化学系张永红教授鉴定）

    除甲醇、乙睛为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司），以下试剂除专门提到外，均为分析醇，实验用水为二次蒸馏水。

2、实验方法

2.1 供试品溶液的制备

    精密称取金线莲粉末1.0g，置于超声一微波萃取仪玻璃容器中，加入50mL 70%甲醇，开启超声微波，控制在恒温50℃下提取40min，萃取3次，合并提取液，浓缩至近干，残渣加入甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2 提取条件的考察

2.2.1 溶剂的选择：精密称取金线莲粉末1.0g，置于超声一微波萃取仪玻璃容器中，分别用水、70%甲醇、70%乙醇溶液超声一微波协同萃取40min（n=3），萃取3次，合并提取液，浓缩至近干，残渣加入甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，HPLC测定萃取率。

2.2.2 溶剂体积分数的选择：分别用体积分数为40%，50%，60%，70%，80%，90%和纯甲醇溶液超声一微波协同萃取30min（n=3），方法同2.2.1。

2.2.3 溶剂用量的选择：分别用l0mL，20mL，50mL，80mL，100mL 70%甲醇提取，方法同2.2.1。

2.2.4 提取时间的选择：分别用70%甲醇超声一微波协同萃取20min，30min，40min，50min，60min（n=3），方法同2.2.1。

2.2.5 提取温度的选择：分别在40，45，50，55，60℃下用70%甲醇超声一微波协同萃取40min，方法同2.2.1。

2.3 对照品溶液的制备



    分别精密称取常温减压干燥12h的天麻素和天麻苷元对照品适量，加甲醇配制成天麻素为200μg/mL、天麻苷元为100μg/mL的混合对照品溶液，冷藏备用。

2.4 色谱条件



    色谱柱：Agilent TC-Cls柱（Sam，4.6*250mm）；流动相：A-0.1%乙酸水溶液；B-甲醇，线性梯度洗脱：0-30min，3%^-5%B；30-35min，5%-20%B；35-40min，20%-20%B；检测波长：270nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

3、结果与讨论

3.1 提取条件的优化结果

3.1.1 溶剂的优化结果：分别用水、70%甲醇、70%乙醇溶液超声-微波协同萃取30min（n=3），结果表明70%甲醇提取天麻素的量较高，而天麻苷元的量差异不明显，因此选择70%甲醇提取。

3.1.2 溶剂体积分数的优化结果：分别用体积分数为40%，50%，60%，70%，80%，90%和纯甲醇溶液超声一微波协同萃取30min（n=3），结果表明，在甲醇体积分数<70%时，天麻素和天麻苷元的提取率随着甲醇浓度的增加而增加；但当甲醇体积分数在70%以上时，天麻素的提取率呈现下降趋势，天麻苷元没有明显的变化。天麻素属于一种酚普，分子量小，极性较大，当甲醇体积分数过高时，溶液极性降低，使得极性较强的天麻素不易溶出，而天麻苷元极性相对天麻素小，影响不明显，因此实验选择70%甲醇作为提取溶剂。

3.1.3 溶剂用量的优化结果：分别用l0mL，20mL，50mL，80mL，100mL 70%甲醇提取，结果表明溶剂体积在50mL时天麻素和天麻苷元的提取率最高，之后随着溶剂用量的增加，天麻素和天麻苷元的提取率趋于稳定，因此溶剂用量选用50mL进行提取。

3.1.4 提取时间的优化结果：分别用70%甲醇超声-微波协同萃取20min，30min，40min，50min，60min（n=3），结果表明超声-微波协同萃取时间从20-40min的过程中天麻素和天麻苷元的提取率逐渐增加；而提取时间超过40min之后，提取率反而逐渐下降。超声一微波协同萃取时间太长，植物中大量细胞细胞破碎，使得大量粘性物质等进入提取液，溶剂杂质增多、粘度增大，影响了有效成分的溶出，有效成分含量反而减少，因此选择提取时间为40min。

3.1.5 提取温度的优化结果：分别在40，45，50，55，60℃下用70%甲醇超声-微波协同萃取40min，实验表明，提取温度在50-60℃的范围内，天麻素和天麻苷元的提取率没有明显差异，考虑到温度太高容易破坏活性成分，因此选择提取温度为50℃。

3.2 流动相的考察

    在实验过程中，流动相首先考察了甲醇-水、乙睛-水等度洗脱对金线莲超声一微波协同萃取样品溶液进行分离，乙睛-水作为流动相时，出峰较快，不能较好地把天麻素和天麻苷元和其他杂质成分分离；甲醇-水作为流动相时，出现峰形拖尾现象，分离效果不理想。为改善上述现象，改用0.1%乙酸代替水并采用梯度洗脱，经过反复筛选之后，最终确定流动相组成为A-0.1%乙酸水溶液，B-甲醇，洗脱程序为0-30min，3%-5%B；30-35min，5%-20%B；35-40min，20%-3%B，天麻素和天麻苷元和其他杂质成分能够很好的分离，得到较理想的色谱图（图1-2（b））。

3.3 对照品溶液和金线莲萃取样品的HPLC-DAD分析

    图1-2（a），（b）分别显示了在上述的色谱条件下，采用DAD进行检测得到的两种混合对照品及金线莲萃取样品的HPLC分离色谱图。图1-2（a）色谱图中天麻素和天麻苷元的保留时间分别为18.74min，26.87min，根据保留时间判断，图1-2（b）中的a，b色谱峰分别初步鉴定为天麻素和天麻苷元。图1-3（a），（b）分别显示了混合对照品和金线莲萃取物中保留时间18.74min，26.87min的色谱峰进行DAD检测后得到的光谱图，天麻素和天麻苷元UV光谱图形状相似，出现二个峰，天麻素峰位置分别为：221nm，270nm，天麻苷元峰位置分别为：226nm，276nm，由于天麻素比天麻苷元多了一个β-D-毗喃葡萄糖基团，天麻素二个峰位置都发生了蓝移，样品中二个峰的光谱图与标准品二个峰的光谱图相同，可以进一步确定金线莲中含有天麻素和和天麻苷元。

3.4 线性范围的考察

    精密移取上述混合对照品溶液0.1，0.5，1，2，3，4，5mL定容于5mL量瓶中，用甲醇稀释配制成不同质量浓度的混合对照品溶液。吸取混合对照品系列溶液，进样20μL，按上述色谱条件测定峰面积，重复进样3次，以峰面积平均值（Y）为纵坐标，对照品浓度X（X：μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：

    天麻素：Y=2562.90X+936.33（R2=0.99990）

    天麻苷元：Y=10135.00X+451.33（R2=0.9998）

    结果表明：天麻素在2μg/ml- 200μg/ml范围内，天麻苷元在在1μg/ml-100μg/ml范围内呈良好的线性关系。

3.5 精密度试验

    精密吸取同一浓度的混合对照品溶液连续进样6次，结果见表1-1，天麻素和和天麻苷元峰面积的相对标准偏差分别为0.60%和0.36%，说明本方法精密度良好。

3.6 重复性试验

    取广西金线莲药材按2.1项下优化后的条件进行样品溶液制备，平行制备6份供试品，按2.3项下色谱条件测定，结果见表1-2，天素和和天麻苷元峰面积的相对标准偏差为1.15%和1.07%，结果表明本提取方法的重复性良好。

3.7 稳定性试验

    取广西金线莲药材按2.1项下优化后的条件制备一份样品溶液，分别在。，2，4，6，8，12，24h测定，结果见表1-3，天麻素和和天麻苷元峰面积的相对标准偏差分别为1.06%和1.19%。表明供试品在24h内稳定性良好。

3.8 加样回收实验

    取广西金线莲药材（过80目筛）6份，各约1.0g，精密称定，分别精密加入天麻素1.4mg及天麻苷元0.5mg，按2.1项下优化后的方法制备，按2.3项下色谱条件测定，结果如表1-4。计算得天麻素、天麻苷元平均回收率分别为95.48%和92.23%。

3.9 样品测定

    取广西金线莲药材，按2.1项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果见表1-5。以外标法计算样品中两种物质的含量，测得金线莲中天麻素和和天麻苷元的含量分别为1.430mg/g及0.562mg/g，相对标准偏差为0.94%和0.25%。

4、结论

    据己有的文献报道，日本学者从高雄金线莲中纯化分离得到活性成分天麻素，台湾学者亦从台湾金线莲水提物中得到相当含量的天麻素及天麻苷元并确认其为重要活性成分。目前，大陆学者较少对大陆金线莲中天麻素和天麻苷元的含量、药理活性以及作用机制进行深入研究。大陆金线莲与台湾、高雄金线莲属于兰科三种不同属的植物，因此，对大陆金线莲中重要活性成分天麻素和天麻苷元进行研究具有重要意义，为进一步综合开发利用大陆金线莲资源奠定理论基础。

    该实验首次应用超声一微波协同萃取法提取广西金线莲药材中的天麻素和天麻苷元，并采用HPLC-DAD进行含量测定，该方法简单方便、灵敏快速。