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血管生成素基因与肌萎缩侧索硬化

2014-11-18  水共山华

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic laceral sclerosis,ALS)是一种同时累及上、下运动神经元的神经系统变性疾病,多数患者病情进展较快,于 3-5 年内死于呼吸衰竭。ALS 可分为散发性 ALS(sporadic ALS,SALS,约占 90%)和家族性 ALS(familial ALS,FALS,约占 10%)。尽管 ALS 确切的发病机制仍未明确,越来越多的证据表明血管生成因子可能参与其中。Lambrechts 等发现北欧 ALS 患者中血管内皮生长因子基因启动子的两个单体型与 SALS 的易患性之间存在相关性。2004 年,Greenway 等发现血管内皮生长因子的下游效应物——血管生成素(angiogenin,ANG)的编码基因的单核苷酸多态(single nuleotide polymorphism,SNP)rs11701 与 ALS 的疾病易患性相关。随后,Greenway 等又在 fALS 和 sALS 患者中检测出 ANC 基因的突变,ANG 成为第 2 个与 ALS 相关的血管生成因子,ANG 基因也被确认为 ALS 致病相关基因(ALS9)。我们就 ANG 基因与 ALS 的关系作一综述。

一、ANG 基因的正常生理功能

ANG 基因位于染色体 14q11,长度为 5.4 kb,由两个外显子组成,但仅第 2 号外显子具有编码功能。ANG 基因编码的蛋白质 ANG 属于胰腺核糖核酸酶超家族的成员,最初产物是含有 147 个氨基酸的前蛋白,在去除含 24 个氨基酸残基的信号肽后成为由 123 个氨基酸组成相对分子质量约 14 100 的成熟的蛋白质。ANG 主要有以下几个功能区:主要维持 ANG 正常分泌的信号肽(由 3 个氨基酸 H13、K40 和 H114 组成)、具有核糖核酸酶活性的催化中心、由第 31-35 位氨基酸残基组成的主要介导人核转运的核定位序列(nuclear localization sequence,NLS),此外还有 1 个受体结合区和 1 个与免疫调节相关的结合域。ANG 在内皮细胞以及健康人胚胎期和成年期的脊髓和背根神经节的胶质细胞、运动神经元均有表达,其表达由缺氧诱导,可调节新生血管形成,促进 tRNA 转录、核糖体的生物合成、蛋白质翻译和细胞增殖,促进运动神经元轴突生长,并具有保护运动神经元免受缺氧引起死亡的功能。

二、ALS 患者 ANG 突变基因的特征

1.ALS 患者 ANG 基因突变的发生率及人种分布:2006 年,Greenway 等在爱尔兰、苏格兰、瑞典、英国、美国 ALS 患者中检测出 7 种不同的 ANG 错义突变。此后,在北美、意大利、法国、德国和荷兰人中也都发现了携带 ANG 突变基因的 ALS 患者,但目前尚未有亚裔和非裔 ALS 患者携带 ANG 突变基因的报道。迄今为止,全世界总共发现 19 个 ANG 错义突变(表 1),ANG 基因突变的 ALS 患者约占全部 ALS 患者的 0.86%,FALS 患者的 2.0% 和 SALS 的 0.7%。因此,ANG 似乎是继 Cu-Zn 超氧化物歧化酶(SOD1)基因、肉瘤熔合(fused in sarcoma,FUS)基因、反式激活反应 -DNA 结合蛋白基因后第 4 位常见的与 ALS 相关的突变基因。各研究中 ANG 基因突变的 ALs 患者的比率从 0 到 2.6% 不等,这可能与人种、研究的样本量大小,以及研究中 FALS 患者和 SALS 患者的比例不同有关。FALS 患者发现的 ANG 突变均呈常染色体显性遗传。

2.ALS 患者 ANG 基因突变的遗传学特征:目前已经发现的位于编码区的 19 个 ANG 突变主要为错义突变,其中有 5 个位于信号肽区,9 个位于 ANG 的 N- 端,其余 5 个位于 C- 端(图 1,2)。在 C39W、K17I 突变发现了基因突变与疾病表型共分离的现象;K17I 突变家系发现了基因不完全外显性,家系中肯定的突变携带者活到 75 岁仍未出现 ALS 相关的临床表现。研究中 ANG 突变基因的致病性分析基于以下几点:证实存在基因突变与疾病表型共分离的现象,对照人群中未见到同样的突变,突变位于关键的位点,使用分析软件证实突变导致蛋白质功能的改变,通过功能研究证实 ANG 突变导致正常生理功能的改变。ANG 催化中心的 3 个氨基酸残基在进化过程中高度保守,这 3 个位点及邻近氨基酸残基的改变均可引起 ANG 核糖核酸酶活性降低,因此 H13、K40 和 H114 及邻近位点的错义突变都具有致病性。K17I 和 I46V 两种错义突变除了在 ALS 患者中检出外,在健康对照中也发现了携带者。由此可见,并非所有的 ANG 基因错义突变都是致病的。

1 肌萎缩侧索硬化患者中已检出的血管生成素基因错义突变及其临床特征

注:a 未注明性别的均为引用文献中作者为保护患者隐私而未提供性别信息;FALS:家族性肌萎缩侧索硬化;SALS:散发性肌萎缩侧索硬化;FUS 基因:肉瘤熔合基因

有意思的是,ANG 突变可以和其他基因的突变同时存在。Millecsmps 等发现 1 例 FALS 患者同时存在 ANG 基因 K17I 突变和 FUS 基因 R52IC 突变,另一例 FALS 患者同时存在 ANG 基因 K54E 突变和 FUS 基因 R52IS 突变,进一步分析发现是 R52IS 和 R521C,而非 K54E 和 K17I 存在基因突变与疾病表型共分离现象,提示这 2 个 ANG 突变可能并非是这 2 例 ALS 患者的致病基因。Penco 等发现 1 个 SOD1 基因 C93D 突变家系中先证者与其他突变基因携带者的发病年龄和病情进展程度存在较大差异,进一步的筛查发现先证者同时携带 ANG 基因 IVS1+27C/T 突变,研究者推测携带 IVS1+ 27C/T 突变的遗传背景可能是先证者较其他 SOD1 基因 G93D 突变携带者发病年龄早,病情进展更迅速的原因。无独有偶,Luigetti 等也发现了 1 例同时携带 SOD1 基因 G93D 突变和 ANG 基因 R12IC 突变的 SALS 患者,其病情进展较其他的 G93D 突变携带者迅速,发病后 2 年半因呼吸衰竭死亡,再次证实 ANG 基因突变可影响 SODI 突变基因携带者的临床表现。

以上结果提示,ANG 基因可能是 ALS 的修饰基因,这些修饰基因和环境因素可能是相同的突变基因携带者临床表型存在异质性的原因。

1 灵长类和哺乳动物血管生成素的氨基酸序列,成熟的血管生成素蛋白的第 1 个氨基酸标记为 1,已发现的突变氨基酸残基用红框标记(图 1,2 均为原创图片)

2 成熟血管生成素的立体结构。核糖核酸酶活性催化中心(H13、K40 和 H114)标记为粉红色,由第 31-35 位氨基酸残基(RRRGL)组成的核定位序列标记为橙色,已发现的突变位点在立体结构的相应位置标出,其中 R31 标记为橙色,K40 和 H114 标记为粉红色,其余的突变位点标记为橄榄色

研究发现 ANG 基因的一些 SNP 与 ALS 的易患性相关。Greenway 等发现 ANG 基因的 rs11701 可增加爱尔兰和苏格兰人 sALS 的易患性,但与美国、英格兰、瑞典人 ALS 的易患性无关。此后,在意大利、法国、德国人中进行的研究均无法复制 rs11701 与 ALS 易患性相关联的结果。然而,最近 McLaughlin 等的研究发现 rs11701、rs9322855、rs8004382、rs4470055、rs17114699 均可增加爱尔兰人 ALS 的易患性,rs17114699 还可增加瑞典人 ALS 的易患性,但这些 SNP 均与波兰人 ALS 的易患性无关联,再次证实 ANC 基因的 SNP 与爱尔兰人 ALS 的易患性有关联。这些研究结果的差异提示不同人种间 ALS 的易患性存在差异。

3.ANG 基因突变的 ALS 患者的临床表型:有关 ALS 患者的 ANG 突变的基因型即临床表型的研究较少,多数 ANG 突变的 ALS 患者的临床表现符合典型的 ALS 的特征。Greenway 等的研究中患者平均发病年龄为 56 岁,其中以延髓症状起病患者的比例高达 600,但其他研究中 ANG 突变的 ALS 患者多数还是以肢体无力、萎缩起病,发病年龄也多在 50 岁以上。此外,各有 1 例 G20G 同义突变、I46V 突变和 K54E 突变的 SALS 患者出现额叶痴呆的表现,还有 1 例 K171 突变的 FALS 患者出现额颞叶痴呆的表现,提示 ANG 突变可能与认知功能损害有关。

三、ANG 基因突变在 ALS 发病机制中的作用

目前尚缺乏有关信号肽的突变的功能研究,推测这些突变可能影响 ANG 的成熟、亚细胞定位及其分泌。成熟的 ANG 有赖于其催化位点和 NLS 这 2 个主要的功能域保持完整,才能发挥正常的生理功能(图 2)。多数 ANG 突变都可影响这 2 个功能域而出现正常生理功能不同程度的降低。Q12L、K17I、K17E、S28N、C39W、K40I、I46V、P112L 突变的 ANG 蛋白的核糖核酸酶活性明显降低至野生型的<1%(K401)到 19%(K17E)不等,对 ANG 晶体结构的分析发现 H114R、R121H 突变也可影响催化中心的形成,从而可能降低核糖核酸酶的活性。K17I、S28N、P112L 突变的 ANG 蛋白的核转运能力明显降低甚至消失,Q12L、K17I、S28N、C39W、K401、P112L 突变的 ANG 蛋白的血管生成活性消失。此外,研究发现野生型 ANG 可保护运动神经元免受缺氧诱导的神经元死亡,而 Q12L、C39W、K40I 突变促进神经突生长的能力降低,丧失神经元保护功能,甚至具有运动神经元毒性作用,可诱导运动神经元的变性,通过注射人重组 ANG 则可延长 SOD1 G93A 突变小鼠的生存期。可见,ANG 基因突变的致病机制主要是由于功能的缺失。

四、展望

ALS 患者中检测出的 ANG 基因突变导致 ANG 功能的缺失,提示血管形成与 ALS 发病机制间存在关联,这为 ALS 发病机制的研究提供了另一个视角。从临床应用的角度来看,ANG 有可能成为 ALS 诊断、判断疾病进展的生物标志。由于 ANG 是迄今为止 ALS 患者中惟一确定的功能缺失基因,通过控制 ANG 的表达水平和活性,可能为 ALS 提供一种新的治疗方案。此外,通过过表达突变的 ANG 基因或者敲除正常的 ANG 基因可望建立转基因鼠 ALS 模型,为研究人类正常的 ANG 功能,以及 ALS 治疗药物筛选提供有效的模型。

编辑: 雨声        

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