(1)端粒与细胞寿命和抗癌[转]

理论上说，细胞的寿命决定于端粒的长度和端粒ＤＮＡ在体内的消减速度。
　　早在1938年，Muller便发现了端粒（Telomere），然而对端粒的深入研究却开始于20世纪70年代后期。端粒酶（Telomerase）是1985年由Blackbun实验室在四膜虫细胞核提取物中首先发现并纯化，随后在尖毛虫（Oxytricha）、游仆虫（Euplotes）及人的Hela细胞等细胞中被证实。有关研究表明，端粒、端粒酶与细胞寿命直接相关，端粒酶的激活和表达程度与肿瘤的发生和转移也有十分密切的关系。
　　1　端粒
　　端粒是存在于真核生物线性染色体末端，由串联重复的短的ｄｓＤＮＡ序列及其相关的蛋白所组成的ＤＮＡ－蛋白复合体。ｄｓＤＮＡ中的一条为富Ｇ链，以5′→3′指向染色体末端，比另一条互补链长8个～12个碱基，这是端粒ＤＮＡ分子的结构特征，是端粒酶识别工作的基础。
　　端粒既有高度的保守性，如原生动物、真菌、植物、动物序列都很相似；又有种属特异性，如四膜虫重复序列为ＧＧＧＧＴＴ，草履虫为ＴＴＧＧＧＧ，人和哺乳动物为ＴＴＡＧＧＧ，等等。
　　端粒的功能除保证ＤＮＡ完整复制外，还在维持染色体结构稳定（保护染色体不分解和染色体重排及末端不相互融合等），染色体在细胞中的定位（使之不随机分布）和引起细胞衰老等方面起着重要作用。众所周知，真核ＤＮＡ是线性ＤＮＡ，复制时由于模板ＤＮＡ起始端为RＮＡ引物先占据，新生链随之延伸；引物ＲＮＡ脱落后，其空缺处的模板ＤＮＡ无法再度复制成双链。因此，每复制一次，末端ＤＮＡ就缩短若干个端粒重复序列，即出现真核细胞分裂中的“末端复制问题”。当端粒缩短到一定程度时即引起细胞衰老，故端粒又称“细胞分裂计时器”。
　　2　端粒酶
　　端粒酶是一种逆转录酶，是一种由蛋白质和ＲＮＡ构成的核糖核蛋白体。其ＲＮＡ成分中含有与端粒ＤＮＡ富G链互补的部分，起着合成模板的作用。
　　端粒酶具有对端粒的延伸作用，在没有端粒酶的细胞中，端粒会逐渐缩短直至损害基因；有端粒酶存在的细胞，则该酶会不断补充新的端粒，使之处于一种不断伸缩的动态平衡中。端粒酶的另一个功能是修复断裂的染色体末端。当断裂的染色体末端有富Ｇ、ＴＤＮＡ存在时，即使没有完整的端粒重复序列存在，它也能被端粒酶作为引物ＤＮＡ并为之延伸端粒序列。因修复断端免遭外切酶对染色体ＤＮＡ的更多切割，端粒酶在某种意义上讲也维护了基因组的稳定性。此外，在端粒合成中端粒酶还具有去除错配碱基的纠错作用，不仅可以除去错配碱基，还可除去延伸超过模板范围的碱基。有实验证实，在嗜热四膜虫的小核中，端粒酶还有影响姊妹染色体分离的作用。
　　不同物种中端粒酶使端粒延伸的反应具有宿主特异性，即无论此酶来源于何种生物，它催化重新合成的端粒都具有宿主生物的特异性。
　　3　端粒、端粒酶与细胞寿命
　　细胞衰老是细胞生命活动的必然规律，Hayflick等指出：细胞，至少是培养的细胞，不是不死的，而是有一定的寿命的；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的极限。这就是著名的“Hayflick极限”。Hayflick等还发现，细胞的增殖能力与供体的年龄有关。如从胎儿肺得到的成纤维细胞可在体外条件下传代50次，而从成人肺得到的成纤维细胞只能传代20次，提示这可能与成人细胞的端粒长度小于胎儿细胞的端粒长度有关。
　　1990年，Harley等人在研究体外培养的人成纤维细胞时，得到细胞衰老过程中端粒损失的直接证据。他们分别取新生儿、24岁、71岁和91岁的供体的成纤维细胞进行体外培养，并使之衰老。结果发现，随着成纤维细胞的不断分裂，染色体末端限制性片段（ＴＲＦ）的长度都逐渐减少，而染色体内部的重复序列并不减少。进一步实验证明，如果细胞不分裂，则ＴＲＦ的长度不减少。说明染色体末端重复序列ＴＴＡＧＧＧ（端粒）在细胞衰老过程中特异地依赖ＤＮＡ复制而丢失。相反，精子中的端粒长度与受试者的年龄无关。这是因为精子中有端粒酶的表达，使端粒保持恒定长度的缘故。所以，端粒的长度被认为是人体细胞寿命的标志。
　　正常体细胞中（生殖细跑、干细胞及外周淋巴细胞等除外），一般很难测知端粒酶的活性。所以随着细胞的不断分裂，染色体末端的端粒序列便会不断缩短，当人的ＴＲＦ缩短到临界长度（Checkpoint）5Kbp～7Kbp时，就有信号指令细胞退出细胞周期（Ｍ１），并启动细胞衰老机制，使细胞出现衰老。如果细胞此时被病毒感染，或某些抑癌基因如Ｐ53、Ｒｂ等发生突变，则细跑可以越过Ｍ１期而继续分裂。此时端粒酶仍然没有活性，端粒长度继续缩短，最终当端粒长度短到极限，即ＴＲＦ为2Kbp～4Kbp时，细跑进入危机期（Ｍ２），这时，由于染色体端粒对染色体的保护作用丧失，染色体不稳定性增加，染色体间出现端—端融合的现象，细胞因而死亡。相反，在有端粒酶活性的细胞中，由于端粒不断得到补充延伸，因而细胞会表现不死性。
　　理论上说，细胞的寿命决定于端粒的长度和端粒ＤＮＡ在体内的消减速度。但有资料表明，有一些动物有较长的端粒而寿命不长，如老鼠的端粒长达50Kbp～150Kbp，而人只有15Kbp，但人比老鼠寿命长得多。在酵母细胞中也发现，酵母细胞分裂24代之后会死亡，但老年细胞没有发现端粒的明显缩短［3］。所以端粒对细胞寿命的影响有多大尚难定论。
　　4　细胞的不死性
　　研究表明：精子等胚性细胞内可检测出端粒酶活性，因而细胞中端粒的长度稳定而且很长，表现为永生细胞；而在没有端粒酶活性的细胞中，随着细胞分裂的进行，当ＴＲＦ长度缩短为2Kbp～4Kbp时，细胞进入危机期（Ｍ２），此时大多数细胞就会死亡。但其中有极少数细胞其端粒酶活性因某些原因被激活，从而使端粒不断维持在一定的长度而不再缩短，因而稳定了染色体，细胞亦逃过死亡成为无限增殖的细胞——肿瘤细胞。所以许多肿瘤组织和转化细胞都在不断细胞分裂中维持稳定而短的ＴＲＦ。
　　据罗建新等报道［4］：对43例鼻咽癌患者活检标本进行检测，端粒酶活性呈阳性者39例，阳性率达90．7％；动物实验也证明，端粒酶活性阳性率随肿瘤的发展过程而增高。此前，日本科学家曾测定了66个原发性胃癌样品的端粒酶活性，其中85%有酶活性。因此他们认为端粒酶的激活可能是肿瘤形成过程中的一个关键步骤。此外，其他的研究者们在乳腺癌、卵巢癌、白血病、结肠癌、肝癌、肾癌中也都测到了端粒酶活性。因此，端粒酶被认为是肿瘤诊断和预防的重要指标。
　　大多数事实证明，端粒、端粒酶与细胞寿命直接相关，且端粒酶的激活和表达程度与肿瘤的发生、发展也有十分密切的关系。因此，如何合理地控制端粒的长度，控制端粒酶的激活和抑制，以达到延缓衰老和防癌、治癌的目的，将会是一项意义深远的、富有挑战性的工作。

由重复排列的端粒构成的DNA四联体结构形态恰好类似弦图结构(目前对端粒的研究表明，端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，包含若干的DNA双链重复序列，其末端为含多个G的单链DNA. 不同物种端粒的重复序列和长度是不一样的，但每种生物体有其特定的序列和平均长度——如人的端粒为(TTAGGG)n，大约在15kb左右. 线状染色体的末端有一段称为端粒的特殊区域，由于一般参与复制DNA的酵素无法作用于染色体的末端，因此这些端粒的主要功能，是使细胞能利用一种称为端粒酶的酵素来复制端粒。如果端粒消失，那么复制过程将使染色体长度缩小。因此这些特化的端帽能保护染色体结尾不被外切酶破坏，并阻止细胞中的DNA修复系统将其视为需修正的损毁位置。在人类细胞中，端粒是由重复出现数千次TTAGGG序列的单股DNA所组成。这些序列富含鸟嘌呤，可形成一种由四个碱基重叠而成的特殊结构，使染色体末端较为稳定。四个鸟嘌呤可构成一个平面，并且重叠于其他平面之上，产生稳定的G-四联体结构。碱基与位在四个碱基中心的金属离子螯合物之间，是经由氢键结合以稳定结构。左图显示由上方观看人类端粒中的四联体，图中可见每四个碱基为一组，共三层碱基重叠而成的单股DNA环状物。在碱基环绕的中心，可见三个螯合在一起的钾离子。也有其他类型的结构存在，例如中心的四个碱基，除了可以是属于单一的一股DNA之外，也可能是由多条平行的DNA各自贡献一个碱基而形成。端粒另外还可形成一种大型环状结构，称为端粒环或T环（T-loop）。是由单股DNA经过端粒结合蛋白的作用之后，卷曲而成的一个大循环。在T环长链最前端的地方，单股的DNA会附着在双股DNA之上，破坏双螺旋DNA与另一股的碱基配对，形成一种称为替代环或D环的三股结构。其中,端粒是由大量串联的重复序列组成的，其中一条链富含G，另一条富含C. 端粒合成时先由端粒酶将端粒重复序列加到富G链上去，再由DNA聚合酶合成富C链. 不同生物的端粒G链一般都采用紧实结构. 而在所有的结构中，G-四联体是理论上最稳定的结构，它除了可在两条DNA分子间形成外，还可以在含四段重复端粒序列单链DNA中形成. Zahler et al考察了端粒DNA的不同折叠方式作为引物时对四膜虫端粒酶的影响. 他们发现端粒G-四联体结构启动端粒酶延伸端粒的效率最差，不能作为端粒酶的引物，另外，他们的进一步研究发现，端粒酶所需的引物可能不应有任何折叠. 折叠的端粒DNA结构由于无法作为引物与端粒酶RNA组分碱基配对、结合，或者改变了端粒引物从端粒酶解离的速度而影响端粒的延伸. 目前，所有已知生物的端粒都是在富G的那条链上由端粒酶进行端粒合成，因此，能促使或稳定端粒形成G-四联体结构的物质或方法可能对癌症有潜在治疗意义. G-四联体结构是端粒DNA末端单链悬挂在溶液中形成的特殊二级结构，由于它在端粒酶催化延长端粒DNA过程中的重要作用，已成为肿瘤治疗和抗肿瘤药物设计开发的重要靶点。如果药物能稳定G-四联体结构或促使其形成，则可使端粒酶不能发挥其逆转录酶活性，不仅抑制端粒酶活性而且使端粒不能延伸。而恶性肿瘤需要一定的端粒长度才能维持其生长及增殖，所以通过促成G-四联体结构的药物可以达到抑制恶性肿瘤生长的目的。)

   注:通过稳定G-四联体结构应该能起到两个作用,在有肿瘤时可以抑制肿瘤的生长,对于健康人则可以延缓端粒的缩短,有助于延长寿命.这是因为由重复排列的端粒构成的DNA四联体结构形态恰好类似弦图结构——实际上DNA结构是在规范场作用下形成的，在能够双链缠绕的地方则呈双螺旋，不能双链缠绕则呈现弦图稳定结构，包括DNA横档平均夹角为36度，这都与规范场分布有关系，场越规范越接近稳定的理想黄金分割结构,在不平衡时可以双向调整，趋于规范分布。金字塔构形的神奇效应也与黄金分割数所约定的几何结构的特殊性密切相关。对于四联体端粒，在正常情况下应该越稳定越好，这对于防治癌症有帮助，因为癌症细胞往往对应非正常时机的染色体变异，而在规范场作用情况下，在需要时可打开四联体结构通过端粒酶实现逆转录，不论在“过稳定”问题。G四联体作为端粒，有点类似十字封手。