肝细胞癌免疫治疗离临床应用还有多远

水共山华 2015-02-08

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随着对 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞亚群的认识以及肿瘤疫苗的研究逐渐深入，临床试验显示单克隆抗体联合吉西他滨治疗，可使 l9% (4/21) 的晚期胰腺癌患者获得部分应答，52. 3% (11/21) 的患者获得疾病稳定。

同时，自然杀伤 (nature kiⅡer，NK) 细胞和树突状细胞 (DC) 介导的主动免疫治疗也已进入临床试验阶段，为既往束手无策的晚期胰腺癌治疗带来了新希望。这使人们不禁要问，对于肝细胞癌 (HCC) 的免疫治疗探索何时才能用于患者呢？本文将试图从 HCC 激发的免疫反应、免疫逃逸以及如何增强免疫应答等方面回答这一问题。

一、肝脏细胞在免疫应答中的作用

肝脏作为体内最大的代谢器官和一级淋巴器官，负责监视膳食摄入的大量多种抗原，识别、中和并清除病原体。由于肝内血流缓慢和肝血窦内皮细胞 (liver sinusoidal endothelial cell，LSEC) 具有特殊的窗孔结构，血循环中各种细胞能与肝脏细胞充分地相互作用。

肝实质细胞约占肝内细胞总数的 65%；肝非实质细胞包括内皮细胞、肝星状细胞 (HSC)、枯否细胞和 Pit 细胞，虽仅占肝体积的 lO%，却在免疫应答中起非常重要的作用。

肝内枯否细胞和 LSEC 是器官定居的抗原提呈细胞 (antigen presenting cell，APC)，通过主要组织相容抗原 (major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ或Ⅱ类分子将吞噬的可溶性抗原提呈给肝内流动的 CD4+ 或 CD8+T 淋巴细胞。正常情况下将抗原提呈给 CD8+T 淋巴细胞的效应倾向于诱导抗原特异性免疫耐受。

Hochst 等发现，小鼠模型中 LSEC 通过甘露糖受体依赖的方式将癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen，CEA) 提呈给 CD 8+T 淋巴细胞，使其对 CEA 免疫耐受，从而无法控制表达 CEA 的肿瘤细胞生长，提示 LSEC 介导的抗原提呈在肿瘤免疫逃逸中起一定作用。

HSC 是具有分化潜能的间充质样细胞，位于肝血窦和肝细胞之间。在慢性炎症和肝硬化时，其表面 CD40、Fcγ RI 和 HLA Ⅱ等 APC 标志表达上调。作为非专职的 APC，HSC 通过 MHC Ⅱ类分子向 T 淋巴细胞提呈抗原，促进 T 淋巴细胞的分化。

Pit 细胞位于肝血窦内，附着在内皮细胞和枯否细胞表面，直接与血液接触，是肝脏特异性 NK 细胞和 NKT 淋巴细胞，其通过释放穿孔素、溶细胞素等杀伤和溶解肿瘤细胞。在肝纤维化／肝硬化及 HCC 时，肝内 NK 细胞的肿瘤免疫监视功能受到抑制。

DC 作为最强效的专职 APC，能捕获、加工并向幼稚 T 淋巴细胞提呈抗原，刺激其增殖和活化。DC 通过表达 MHC Ⅰ和 MHC Ⅱ分子、共刺激分子 CD40 和 B7、黏附分子和白细胞介素 12（IL-12）及干扰素γ(IFN γ) 等细胞因子激活抗原反应信号，为 T 淋巴细胞免疫应答提供最佳的共刺激环境。

肝内的 DC 来源于骨髓，多为不成熟的 DC 前体，不能活化幼稚的 T 淋巴细胞。HCC 时，由于 IL-IO 等细胞因子局部作用，DC 的成熟和抗肿瘤功能受到抑制。因此，现有研究致力于在体外培养激活 DC，纠正其对肿瘤的免疫抑制，回输至患者体内后重新激发其抗肿瘤免疫作用。

二、肝细胞癌免疫逃逸的机制

肿瘤免疫监视的概念近年来被重新定义为“免疫编辑”，这一概念包含了三个阶段：清除阶段，即肿瘤细胞被清除；平衡阶段，免疫系统控制肿瘤细胞的生长；免疫逃逸阶段。

免疫平衡阶段控制肿瘤的关键取决于 T 淋巴细胞是否能够识别肿瘤抗原并激发有效的免疫应答。免疫逃逸阶段的特点是肿瘤细胞通过下调 MHC Ⅰ类分子和肿瘤抗原的表达，逃避免疫系统的监视，这一阶段被认为是“免疫编辑”最重要的阶段。

1．抑制免疫的细胞数增加：(1)调节性 T 淋巴细胞：HCC 患者的外周血和肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltratinglymphocytes，TIL）中 CD4+CD25+FoxP3+ 调节性 T 淋巴细胞 (regulatory T cell，Treg) 的比例增加。

肿瘤组织中的 Treg 具有高免疫活性，能有效抑制 CD4+T 淋巴细胞应答，CD8+T 淋巴细胞增殖、活化和效应功能，以及抑制 NK 细胞功能。Pedroza-Gonzalez 等对 HCC 和结肠癌肝转移的患者研究发现，肿瘤和肿瘤间质中 Treg 比例增加，NK 细胞、NKT 淋巴细胞和 CD8+T 淋巴细胞比例下降，同时 CD8+T 淋巴细胞表达穿孔素和颗粒酶 B 下调，且 LM-CRC 中的 Treg 对 T 淋巴细胞应笞的抑制能力更强。

肿瘤中 Treg 上调肿瘤坏死因子受体家族成员的表达，予该受体可溶性配体处理后，可阻止 Treg 介导的免疫抑制，并恢复 CD4+CD25 T 淋巴细胞功能。(2)髓源性抑制细胞：髓源性抑制细胞 (myeloid-derived suppressor cells，MDSC) 是一群异质细胞，包括髓系祖细胞、未成熟巨噬细胞、粒细胞和 DCs。其特征是表达 CDllb 和 CD33，低表达或不表达人类白细胞抗原(HLA)-DR，并具有高精氨酸酶活性。

Hoechst 等研究发现，HCC 患者外周血和肿瘤组织中 MDSC（CD14+HLA-DR-/low 表型）显著升高。MDSC 活化后可通过上调精氨酸酶 I 活性诱导 Treg 功能，促进其分泌 IL-lO，抑制肿瘤特异性 T 细胞活化和 NK 细胞功能。此外，将 HCC 患者的 MDSC 和 NK 细胞共培养后，MDSC 通过 NK 细胞表面的 NKp30 受体接触抑制自体 NK 细胞毒性和细胞因子分泌。

2．缺乏辅助性 T 细胞：辅助性 T 淋巴细胞 (helper T cell，Th) 根据表型可分为 Thl、Th2 和 Th17 细胞。APC 通过 MHC Ⅱ分子将抗原提呈至肿瘤相关抗原致敏的 CD4+Th（主要为 Thl），后者分泌细胞因子活化 CD8+CTLs、NK 细胞和巨噬细胞，达到清除肿瘤的目的。

早期 HCC 患者血清甲胎蛋白 (AFP) 轻至中度升高时，在其外周血和肿瘤组织中能检测出较低水平的 AFP 特异性 CD4+T 淋巴细胞应答。但当进展期肿瘤、血清高 AFP 水平时，却检测不出这种反应。因此，缺乏 AFP 特异性 CD4+Th 可能是导致 CD8+T 淋巴细胞耗竭的原因。

3．T 淋巴细胞抑制性受体表达增加：HCC-TAA 致敏的特异性 T 淋巴细胞表面抑制性受体表达增加，如细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4 (cytotoxic T lymphocyteantigen-4，CTLA-4)、B 和 T 淋巴细胞弱化因子 (B and T lymphocyte attenuator，BTLA)、T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子一 3(T ceu immunoglobulin-and mucin-domain- containing molecule-3,TIM-3) 和程序性死亡 -1（programmed death-1,PD-1)等。

Th1 细胞表达的 TIM-3 与其配体半乳糖凝集素 9 相互作用后，可负向调节 Th1 介导的免疫反应。Li 等发现 HCC 患者的枯否细胞和 DC 等抗原提呈细胞广泛表达半乳糖凝集素 9，而肿瘤组织中 CD4+ 和 CD8+T 淋巴细胞表达 TIM-3 上调。予抗 TIM 3 抗体阻 TIM 3／半乳糖凝集素 -9 信号途径，可增强 T 淋巴细胞分泌细胞因子 IL-2 和 IFNγ，恢复 HCC 效应 T 淋巴细胞功能。

PD-1 是一负性共刺激分子，主要表达于 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞，可抑制抗原特异性 CD8+T 淋巴细胞活化和记忆细胞的形成。HCC 中的枯否细胞、MDSC 和肿瘤细胞通过上调 PD-1 配体 (PD-L1／2) 的表达，与 TIL 表面上调的 PD-1 相互作用，可诱导 CD8+T 淋巴细胞凋亡，减少 IFN γ、肿瘤坏死因子α和 IL-l2 等细胞因子的分泌。

多中心Ⅰ期临床试验显示：予 PD-L1 抗体治疗进展期肺癌、肾癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等恶性肿瘤，可使 9／52 黑色素瘤、2／l7 肾细胞癌、5／49 非小细胞肺癌及 1／17 卵巢癌患者获得部分和完全应答，且大部分患者可耐受 PD—L1 抗体治疗。

总之，肿瘤相关抗原处理和提呈缺陷、肿瘤特异性 T 细胞上调抑制性受体表达、免疫抑制细胞数量增加、辅助性 T 淋巴细胞缺失以及 NK 细胞功能受到抑制等因素，都参与 HCC 免疫逃逸。

三、肝细胞癌免疫治疗的动物实验和临床研究现状

增强 HCC 的免疫原性，使 T 淋巴细胞能够识别肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen,TAA），并激发有效的免疫应答是免疫治疗 HCC 的关键。常见的 HCC-TAAs 见表 1。通过比较和分析各种 TAAs 后发现，大部分 HCC 患者对 AFP 具有特异性 CD8+T 淋巴细胞应答，77.4%(24／33)HCC 患者至少对一种 TAA 肽段呈现特异性 T 淋巴细胞应答。

MizLlkoshi 等报道亲环素 B、鳞状细胞癌 T 淋巴细胞识别抗原 2(Squamous cell carcinoma antigen recognized byT cells 2,SART2)、SART3、p53、多重耐相关蛋白 -3、AFP 和人类端粒酶逆转录酶 (human telomeraSe reverse transcriptase,hTERT) 等 TAA 更具有免疫原性, 易被 T 淋巴细胞识别，并能诱导特异性 CTL。

因此，现有的研究致力于使 T 淋巴细胞针对 HCC-TAAs 产生有效且持续的免疫应答；加用细胞因子刺激和加载肿瘤抗原，活化和改善 DC 功能，维持长期的免疫应答并诱导记忆细胞产生，从而监视和清除肿瘤转移细胞。现有的肝细胞癌免疫治疗大部分还处于动物实验阶段（表 2）。

上述 HCC 免疫治疗在动物模型中大多能产生 T 淋巴细胞特异性应答，抑制肿瘤的生长并减少复发；但无论是 TAA 疫苗还是 DC 疫苗，或是两者联合应用在现有临床试验中的效果仍不理想，仅有少部分患者能达到部分应答或在随访期间疾病稳定（表 3）。这可能与患者体内肿瘤负荷和个体性差异有关。

肿瘤免疫耐受的微环境和免疫抑制机制的多样性导致治疗效果的不确定性，也是免疫治疗不能进展到大规模 III 期临床验证的原因。因此 HCC 免疫治疗仍处于早期发展阶段。

希望经过努力，免疫治疗能辅助 HCC 的常规治疗方案，降低肿瘤负荷。同时，如能联合阻断免疫调节细胞（如 Treg 和 MDSC）和免疫抑制受体、增强 TAA/DC 疫苗活化 Thl 细胞、预防对 HCC 特异性抗原的免疫耐受，离达到建立稳定的免疫应答、有效清除和监视肿瘤复发的目标将为期不远。何时临床验证能肯定现有 HCC 免疫治疗手段达到确凿的治疗效果还需较长时间的探索。