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微生物在自然界中无处不有，土壤里、水中、空气里、人体上、动植物体上以及培养食用菌的培养料、设备、工具上都有微生物存在。对食用菌来说，其中相当部分是有害的 。我们通常将这类有害的微生物统称为杂菌。人工栽培食用菌，要求丰产、稳产、优质，就要排除杂菌的危害和干扰，即彻底做好消毒灭菌工作是栽培成功的前提。 一、常用术语 消毒 消毒原是医学上的一个概念。它的原意是指杀死病原微生物，防止疾病传播。就食用菌生产而言，消毒是杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再危害食用菌的生长发育。经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等并不会完全死亡，它们仍能发芽，消毒后的环境里，物品上还会存活部分活着的微生物。 灭菌 是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把有生命的物质全部杀死。 杀菌 泛指杀死微生物菌体(不论是否有害)，一般不包括芽孢。具有这种效力的药剂称为杀菌剂。 抑菌 即阻止菌体的生长繁殖。具有这种作用的药剂为抑菌剂。 无菌 不存在任何活着的微生物。经过灭菌后的物品就是无菌的。 杂菌 在某一培养基中，除了要求培养的微生物外，其他的微生物都称为杂菌。 防腐 通过杀菌或抑菌达到防止物品腐败霉变的目的。具有这种效能的药剂称为防腐剂。 无菌操作 即操作的空间(如接种室、接种箱的空间)，使用的器皿和工具，操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。 二、消毒与灭菌的方法 消毒与灭菌的方法很多，可分为物理方法和化学方法两大类。 (一)物理方法 1.干热法 在干燥的条件下，加热进行灭菌。 (1)灼烧灭菌 将物体置于火焰上，直接烧死附于物体上的微生物。此方法的特点是操作简便、灭菌迅速彻底。但应用范围有限，仅适用于耐热或供毁灭废弃的物品，如接种针、接种环、试管口或三角瓶口，可通过酒精灯火焰灼烧灭菌。严重污染杂菌的菇体和物体也可用火焰灼烧而灭菌。酒精灯用的酒精浓度以95%为宜，浓度低燃烧不良，热力不足，灼烧灭菌的效果差。 (2)干热灭菌 将需要灭菌的物品置于干燥箱中，加热到160℃，保持1～2小时，利用箱内的热空气杀死物体上的微生物。此法适用于玻璃器皿、金属用具等耐干热物品的灭菌。其优点是可以保持物品的干燥。 2.湿热法 是在有水的条件下加热。如用热水、热蒸汽杀死微生物。实验证明，细胞原生质在含水量高的情况下更易变性凝固，而且蒸汽的穿透力强，在同样温度下，湿热杀菌效果比干热法效果好。主要介绍经常用的巴斯德消毒法、间歇灭菌法、常压灭菌法和高压灭菌法。 (1)巴斯德消毒法 也称低温消毒法。即用较低的温度(60℃～700℃)杀死物品中的病原菌和大多数细菌白勺营养体。此法适用于不耐高温物品的消毒。栽培食用菌时常用的培养料发酵，即利用这个原理杀死其中的有害微生物。 (2)常压间歇灭菌法 利用流通的热蒸汽几次反复杀菌的方法。物品放在蒸锅或蒸笼内，加热至蒸汽上冒后，再继续蒸煮15～20分钟(根据不同的物品而定)，以杀死其中的微生物营养细胞。然后冷却，并将灭菌物取出，置室温下或25℃～30℃温箱中培养24小时，让其中芽孢萌发成营养体，再放入蒸锅中以同样的方法加热灭菌。如此连续三次，即可杀死灭菌物的全部芽孢，达到灭菌的目的。此法由于不需加压，只要有普通的家庭用蒸笼即可，但操作需用时间长。间歇灭菌法常用于不耐高温物品的灭菌。 (3)常压蒸汽灭菌法 又称流通蒸汽灭菌法。做法与间歇灭菌法相似，但需延长热处理的时间(4～8小时)，使物品中的微生物营养体和芽孢全部死亡，达到一次性灭菌的目的。此方法不仅可以灭菌，而且又有利于培养料中的有机质达到部分分解的目的，加之条件简易，操作方便，因此已被菇农用于制作原种、栽培种的培养基灭菌和熟料栽培的培养料灭菌。 (4)高压蒸汽灭菌 以上两种蒸汽灭菌法，由于是在常压下进行，蒸汽温度只有100℃左右，热处理较长。若利用密闭的蒸锅，使其中的蒸汽不外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，锅内温度也随之增加。这样杀灭细菌芽孢所需的时间可大大缩短，所以是一种最有效的灭菌方法。高压蒸汽灭菌时间短，效果可靠，适用于一般培养基和一切耐高温物品的灭菌。 3.紫外线灭菌 紫外线灭菌是利用辐射因素来灭菌的方法之一。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸会发生变化，当辐射量超过一定限度时，轻者突变，重者死亡。紫外线灭菌是用紫外线灯管进行的。紫外线的波长为200nm～300nm，均有灭菌效果，其中以260nm的杀菌能力最强。由于紫外线穿透物质的能力很差，所以只适用于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2m为宜。接种室和接种箱，常用紫外线灯作为空气和桌面的消毒。紫外线对人的眼粘膜及视神经有损伤作用，应避免直接在紫外灯下工作，更不能直视灯管。 4.过滤除菌 对于不适宜用热力灭菌的液态和气态物质，可用过滤的方法除去其中的微生物。常见的试管口上加棉塞，就是起过滤除菌作用。 (1)液体过滤 有些培养基加热后，其中的某些成分易被分解，如血清、酶、维生素、抗生素及某些化学药品等，可用压滤或减压抽滤的方法，使之通过带有许多微小孔隙的过滤器，把其中的微生物阻隔在过滤板上除去。过滤器的种类很多，主要有瓷土制过滤器，硅藻土制过滤器、滤膜过滤器等。每种过滤器按孔径大小分成不同型号或等级，使用时可根据需要选择。 现以滤膜过滤器为例介绍具体安装和使用。滤膜是用火棉胶、醋酸纤维素或其他类似的物质制成，厚度0.1mm。将膜剪成与特制过滤器的漏斗直径大小相仿的圆片，置漏斗上，再将过滤器装在抽滤瓶上，以橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶(中间可连一水银检压计)，最后将安全瓶用橡皮管接于真空泵上(图4—6)。将待除菌的液体，以无菌操作注入滤器内，开动真空泵即可过滤。薄膜上的微孔直径有0.005um～1.０um等规格，滤除一般细菌，选用0.1um～0.2um的即可，过滤时间不宜过长，因低压能使屈曲运动的细菌通过滤器；也要避免高度减压，因微小颗粒会堵塞滤板，而失去过滤效能。一般以100mm～200mm水银柱减压为限。 (2)气体过滤 在生产液体菌种的深层发酵工艺中，需要大量无菌空气，采用气体过滤方法，使空气通过多层棉花和活，哇炭，滤除空气中的微生物。现许多发酵工业的厂家，已逐步采用超细玻璃纤维代替棉花和活性炭，其优点是体积小，使用方便，节省材料，但超细纤维滤纸不能受潮。 消毒与灭菌的效果，直接影响菌种成品率的高低。因此不但要把好消毒灭菌关，而且还要严格执行检验制度。 (一)培养基灭菌效果的检查 每采用一种新的培养基，或使用一种新的灭菌设备，以及变更灭菌的压力和时间，都必须进行灭菌效果的检验。具体方法是：把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。 (二)接种室(箱)消毒灭菌效果的检验 1.检查方法 常用的检查方法有平板法和斜面法两种 (1)平板法 用常规培养基如肉汤琼脂，马铃薯葡萄糖琼脂等，分别倒成平板，每种两个，放入接种室或接种箱。检验时，按无菌操作各将其中一个平板的盖子打开，经过预定时间再盖好；另外一个不开盖子作为对照。然后一起放在30℃下培养48小时后检查有无菌落出现。 (2)斜面法 将以上的常规培养基斜面各取2管，放入接种室或接种箱。按无菌操作各将其中一管棉塞打开，把棉塞放入灭菌的培养皿内，经过一定时间再将棉塞塞好，连同对照一起放入培养室培养，温度和时间同前。 2.检验内容 (1)空气熏蒸效果检验 接种室(箱)用福尔马林或其他药剂熏蒸后，在开始使用前半小时打开培养皿(或试管棉塞)，至使用时盖(塞)好。 (2)紫外线灯灭菌效果检验 接种室或接种箱用紫外线灯照射后，分别在不同的高度和不同的位置用前面的方法检验空气中的杂菌，以判断紫外线灯的灭菌效果。必要时调整紫外线灯的照射时间或悬挂高度，或更换新的灯管。 (3)操作过程中空气污染情况检验 为了检验在使用接种室过程中，由于人员进出、器材搬放、操作动作等原因造成的空气污染，可在准备工作结束后，接种操作开始时打开盖子，经过5分钟、30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同使用时间内空气的污染程度。 3.检验结果分析 检验用的平板或斜面在30℃下培养48小时后取出观察。根据是否长菌落和菌落的数量、菌落的形态，来判断空气污染的程度和杂菌的种类。一般要求平板开盖5分钟者不超过3个菌落；斜面开塞30分钟者不长菌落。若所长的菌落超过这个数字，应考虑采取有效措施提高灭菌效果或改进操作方法。如菌落中霉菌较多，则可采用乳酸和福尔马林交替熏蒸的办法。 |
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