应用：细胞表面成份的研究胶体金技术与冷冻蚀刻技术结合-细胞膜蛋白颗粒或其它膜成份进行精细定位电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出
基因位点免疫胶体铁细胞化学染色法胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还
具有一定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。酶免疫电镜技术酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应
形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。第六节免疫组化技术的应用一、免疫组织化学技术的临
床应用荧光免疫组织化学技术的应用自身抗体的检测游离在外周血中的抗体固定在组织中的的抗体HEP-2细胞抗着丝粒抗体的
阳性显色肾小球抗基底膜抗体的阳性显色细菌、病毒的快速鉴定藤黄微球菌绿色-活菌红色-死菌寄生虫的检测与研究猴胚肾细胞内
弓形虫繁殖吖啶橙染色绿色-DNA红色-RNA恶变组织中肿瘤抗原的检测人肝癌细胞吖啶橙染色其他：免疫荧光技术也应用于
血液中B细胞和T细胞及其亚群的鉴定、特殊染色体的鉴定、激素和酶的局部组织定位等方面。酶免疫组织化学技术的应用提高病理诊断准确
性（HE可观察到炎性细胞浸润，ED1染色可观察到巨噬细胞浸润）Survivin在肝癌细胞核的表达癌基因蛋白的临床应用对肿瘤
细胞增生程度的评价Ki67在小肝癌组织中的表达肿瘤转移分期判断肿瘤的靶向治疗辅助诊断免疫性疾病和感染性疾病，观察免
疫复合物沉积状况二、免疫组织化学技术的拓展荧光激活细胞分类仪（FACS）FACS是将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、激光和
微机信息处理系统等多学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与应用研究的一种先进仪器FACS原理示意图488nm
laser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSin
glecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetecto
r共聚焦显微镜技术的应用“细胞CT”！激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMic
roscope，简称LSCM)工作原理共轭光路使非焦平面的光线被抑制，减少了干扰，以及使用光色较纯的激光，
所以成像分辨率更高增加了激光扫描部分，可连续、固定范围内小功率扫描，记录动态变化光学结构为共轭聚焦结构，此结构可使样品中间固定层面
被激光扫描，通过调节参数可实现样品的多层扫描，俗称“细胞CT”一般荧光显微镜（左）与激光共聚焦显微镜（右）的区别LSCM应用
广泛罗丹明123染细胞线粒体细胞器研究-籍特异性荧光探针。图像清晰，可动态观察活细胞鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝检测
人类癌细胞表皮生长因子肿瘤细胞间通讯研究分层扫描、光学切片XYZXYZ焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平
面或xz切面）光学切面模式图细胞测量细胞“CT”片分层扫描、光学切片较厚层面
较薄层面人血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞较厚层面(平滑肌损伤可见
)较薄层面兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞三维重建-生物结构分析植物切片三
维重建免疫荧光定量、定位测量随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值细胞内离子测定细胞胞浆胞核同时动态测量Ca
离子胞核胞浆细胞膜流动性测定其他：随着新软件的不断开发及各个学科的不短发展和相互渗透，LSCM还将会有更广阔的发展前景，并
将生命科学的基础研究引向深入。三、显微切割技术显微切割技术是在显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞，细胞内
组分等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。根据研究的需要可在显微切割前应用免疫组织化学、原位杂交等方法对需要切割的组织内成
分进行标记。显微切割仪思考题免疫组织化学技术有几个主要步骤？免疫组织化学技术操作中的主要注意事项？何为直接法、间接法、补
体结合法荧光免疫组化技术？其各自优缺点如何？何为直接法、间接法、酶免组化技术？其各自优缺点如何？何为酶桥法、PAP、APPAP
法技术？其各自优缺点如何？何为生物素－亲合素法？常用的技术类型及特点如何？何为葡萄球菌A蛋白法、凝集素法、链霉生物素－亲合素法
？何为免疫电镜技术的原理？胶体金技术特点如何？免疫组织化学技术的临床应用如何？共聚焦显微镜技术的原理和临床应用？小结
免疫组织化学技术采用了标记抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定。该技术的应用
便于在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了
强有力的手段。免疫组化技术进入了一个全新的发展阶段，图像分析、流式细胞技术的运用，使免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。
免疫组织化学技术已成为现代生物医学研究和实际工作特别是临床检验工作中不可缺少的工具。第三节酶免疫组织化学技术定义:是在一定
条件下，应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原(抗体)的分布
位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。一、组织处理常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，其固定及
标本制作方法见第一、二节。与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微
结构等优点。二、酶标记抗体免疫组化染色定义:借助交联剂的共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特
异性催化作用，生成不溶性有色产物，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。常用的方法:直接法
间接法三、非标记抗体酶免疫组化染色特点:用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体酶通过免疫学
反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体结合，最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测避免了酶标记抗体对抗体的损伤，提高了方
法的敏感性技术类型酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成
酶联的抗原-抗体复合物，底物显色+++HRP底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源抗酶抗体/Ab3Ag-Ab
1-Ab2-Ab3-HRP复合物AgAgAgAg优点：敏感性较酶标法有所提高缺点：操作分四步，较复杂
如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题如果抗酶抗体的非特异性成分与桥
抗结合，结果就与抗酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的敏感性PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗
酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物)+++AgAg底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1兔源PAP复合物
AgAgAg-Ab1-Ab2-PAP复合物特点:操作只需三步PAP复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端桥连
抗体存在的非特异性抗体，不能与抗酶抗体结合抗酶抗体中存在的非抗酶抗体不能与酶结合，不会有酶活性，因而大大减弱背景着色双桥P
AP法基本原理:是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。这种放大方式
由于重复使用桥抗体，使桥抗与PAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的Fc段结合，或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显
放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。APAAP法：有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色时就不宜使用HRP体系。用
碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶(AAP)法，简称APAAP法+++底物二抗/Ab2兔源一抗/
Ab1Ag兔源APAAP复合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-APAAP复合物四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色
底物常用种类:辣根过氧化物酶/HRP底物显色棕色或灰蓝色最常用碱性磷酸酶/AP底物显色玫瑰
红色或深蓝色最敏感葡萄糖氧化酶/GO底物显色蓝色敏感性较低，显色底物不易保存β-半
乳糖酶等酶的选择:HRP染色结果比AP染色结果保存时间长含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为AP
AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰第四节亲合组织化学染色亲和组织化学（Affinity
histochemistry）是利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素、生物素
和葡萄球菌A蛋白等，都对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,可采用荧光显微镜、
酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。一、生物素-亲合素法生物素/B
iotin:即维生素H，是一种碱性蛋白。亲合素/Avidin:也被称为抗生物素，它是由4个相同亚基组成的大分子糖蛋白，具有4个与
生物素亲和力极高的结合点，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性它们都具有与其它示踪剂结合的能力。亲合素-生物素-过氧化酶复合
物技术AvidinBiotin–PeroxidaseComplextechnique，ABC原理：预先按一定比例将亲合
素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC
中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原－抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。待测抗原非特异性
抗原A-亲合素B-生物素E-酶ABC直接法原理示意图ABC间接法原理示意图待测抗原非特异性抗原A-亲合素
B-生物素E-酶缺点：有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理?ABC复合
物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合优点：敏感性高
特异性高一抗和二抗工作浓度低操作时间缩短可以多重标记桥联亲合素-生物素技术Bridged
Avidin-Biotintechnique，BRAB原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系
中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗
原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
BRAB直接法原理示意图待测抗原非特异性抗原A-亲合素B-生物素E-酶BRAB间接法原理示
意图待测抗原非特异性抗原A-亲合素B-生物素E-酶标记生物素-抗生物素技术LabelledAvidin-bio
tintechnique，LAB原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。特点:相当高的灵敏度
，省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。间接LAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高检测灵敏度二、
葡萄球菌A蛋白法定义:葡萄球菌蛋白A/SPA是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物IgG的Fc段结合，用S
PA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验SPA可以和人及多种动物的IgG结合，解决不同动物
检测时，需分别标记相应二抗的问题SPA结合部位是Fc段，因此不会影响抗体的活性SPA具有双价结合力SPA对IgG?亚型的结合
有选择性，可能出现的假阴性结果三、凝集素法凝集素/lectin是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋
白或结合糖的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素凝集素具有与特定糖基专一结合的特性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具凝集素法就
是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲合反应直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细
胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应-凝集素
-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”的结合物。四、链霉亲合
素-生物素法(LSAB）链霉亲合素(StreptavidinSA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4
个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标
链霉亲合素-生物素方法LSAB法具有几大特点：可结合更多的生物素化的二抗，放大效应远远超过ABC法低背景着色操作时间缩短
第五节免疫电镜技术一、免疫标记电镜技术的原理免疫电子显微镜（ImmunoelectronMicroscope，IE
M）技术是利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物，在电子显微
镜下对高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。特点:定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器在探索病因、
发病机制、组织发生等方面有其独特的优点二、免疫标记电镜技术标本的制备要求标本制备的要求是保存良好的细胞超微结构，注意保持组织
的抗原性，因此在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强。在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。三、
常用的免疫标记电镜技术免疫胶体金染色法免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术胶体
金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。它在弱碱环境下可与蛋白质
分子形成牢固的静电结合而不影响蛋白质的生物特性。分类：按染色步骤直接法间接法按标记与包埋的关系包埋前标记法
：抗原活性保存较好，标记率较高包埋后标记法：可对一个材料反复进行标记，试剂用量少前列腺内分泌-旁分泌细胞免
疫胶体金染色显示有降钙素的沉积第十三章免疫组织化学技术第一节???免疫组织化学技术概述一、标本的处理二、抗原的保
存与修复三、抗体的处理与保存四、免疫组化的结果判断五、质量控制第二节???免疫荧光组织化学技术一、组织
处理二、荧光抗体的标记及染色第三节??酶免疫组织化学技术一、组织处理二、酶标记抗体免疫组化染色三、非标记抗体免
疫酶组化染色四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物第四节亲合组织化学染色一、生物素-亲合素法二、葡萄球菌A蛋白法三、
凝集素法四、链霉亲合素-生物素法第五节???免疫标记电镜技术一、?免疫标记电镜技术的原理二、免疫标记电镜技
术的标本制备要求三、常用的免疫标记电镜技术第六节??免疫组织化学技术的应用一、???免疫组织化学技术的临床应用
二、???免疫组织化学技术的拓展思考题小结免疫组织化学技术（Immunohistochemistry
Technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进
行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。免疫组织化学的基本过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，
制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将标记物与抗体结合形成标记抗体；4.标本的处理与制备；5.抗原抗体免疫学反应以
及标记物呈色反应；6.观察结果。第一节 免疫组织化学技术概述根据标记物的性质不同分类：荧光免疫组织化学技术
酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术亲和免疫细胞化学技术免疫标记电镜技术等标本的类型组织
片标本：活组织检查标本，手术切除标本细胞片标本：组织印片、铺片、培养的粘附细胞、体液、穿刺液的细胞悬液涂片一、标
本的处理标本的固定良好的固定是免疫组织化学结果可靠的重要保证固定的原则：不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜
的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定
剂蛋白质抗原—乙醇或甲醇微生物抗原—丙酮或三氯化碳组织切片技术冰冻切片：较好地保存组织抗原的免疫活性石蜡切片：
形态保存好，可以用于回顾性研究首选，适用于不稳定的抗原是观察组织细胞结构的理想方法，有连续性。但抗原保存不如冰冻切片。二、抗
原的保存与修复抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化
学的信号减弱或消失等不良效应。所以，使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。常用的方法有：酶消
化法盐酸水解暴露抗原法微波炉恢复抗原法高压锅恢复抗原法
煮沸恢复抗原法无花果蛋白酶—轻度消化酶胰蛋白酶—中度消化酶胃蛋白酶—强消化酶掌握盐酸浓度、水解温
度、时间、以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原借助微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，已暴露掩盖的抗原决定簇。
经济简单，适用于大批切片也是利用热效应恢复抗原性三、抗体的处理与保存抗体的选择注意选择具有高特异性、稳定的优
质抗体多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低抗体的稀释抗原抗体反应要比例合适才能达到
预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度抗体的保存分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）
根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低四、结果判断必须设立对照对照实验：
阳性对照阴性对照确证实验：空白实验替代试验
吸收或阻断试验设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体。采用已知抗原阳性标本与待检标本同时进行以排
除假阳性用缓冲液代替第一抗体，以排除组织细胞内所含的生物素或内源性酶。直接法常采用。用与待测抗原同一种动物免疫前血清或非免疫血
清代替第一抗体已确认阳性反应不是异嗜性抗原所致非特异性反应。直接法和间接法均可采用先用已知过量抗原与第一抗体反应，离心后再进行组
化染色，此时的阳性标本应呈阴性，其目的在于确认阳性反应是与天然抗原相同的抗原抗体反应，间接法常采用。阳性细胞显色分布类型
细胞质细胞核细胞膜表面阳性细胞显色：抗原分布于细胞核阳性显色深浅反映抗原存在的数量，可以作为
定性的依据定位的依据定量的依据阳性细胞呈散在分布阳性细胞分布分为散在分布灶性分布
弥散分布阳性细胞呈灶性分布阴性结果和抗原不表达阴性结果:不能简单认为具有否定意义，阳性表达有强
弱、多少之分，只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要视为阳性表达,不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。特异性染色与非特
异性染色特异性染色非特异性染色分布在特定的部位,具结构性（如细胞质、细胞核、或细胞表面）无分布规律，常出现在切片边缘、刀
痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域由于细胞内抗原含量不同，所以显色不均一不限于单个细胞，而是累及一片细胞，均匀显色阳性与阴
性细胞相互交杂，同一切片上显色强度不一细胞和周围的结缔组织均无区别的着色免疫组化结果与HE染色结果当免疫组化诊断结
果与HE切片诊断不一致时,应再结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线等影像学及实验室结果综合分析,不能简单地推翻HE切片诊断。
（HE，苏木精-伊红染色）五、质量控制抗体特异性、敏感性测试抗体最佳稀释度的选择稀释剂抗体孵育温度
、时间试剂的质量控制包括第一抗体和第二抗体预试验质量操作过程质量控制操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作人
员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型质控品，可用于监控标本制备、操作过程、
染色步骤、试剂质量等问题引起的误差仪器的质量控制相关技术设备、仪器和器具定期校对、对试管、吸管、移液器等消毒。第二节免
疫荧光组织化学技术定义:采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复
合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原(或抗体）物
质定位、定性和定量测定的目的。一、组织的处理标本的类型：涂片和印片组织切片铺片
培养的粘附细胞悬浮细胞活细胞标本的保存：标本固定干燥后，最好立即检测
保持干燥、置4℃甚至-20℃以下保存二、荧光抗体的标记及染色常用的荧光素：FITC黄绿色；RB200、TRITC橙红色；PE红色；AMC蓝色；Cy3橙红色；Cy5红色；德克萨斯红橙红色标记方法：搅拌法、透析法标记抗体的纯化：游离荧光素、未标记或过度标记蛋白的去除标记抗体的质量鉴定：抗体特异性、效价、荧光素与蛋白质结合比率F/P荧光免疫组化染色直接法：优点：操作简便、特异性高缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦抗原标记抗体标本载玻片间接法：优点：较直接法灵敏，标记一种抗体可以鉴定多种抗原缺点：非特异荧光、操作时间较长补体法：优点：敏感度较高、标记一种抗体可以鉴定多种抗原、适用于任何动物的抗原抗体系统缺点：非特异荧光、需新鲜补体、操作麻烦标本抗原抗体载玻片标记抗补体抗体固定补体双标记荧光免疫染色法：用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本中的相应两种抗原同时显示标记抗体A抗原A抗原B标记抗体B标本载玻片非特异性荧光产生某些组织细胞、衰老细胞有自发荧光抗体不纯所出现的交叉反应标记抗体质量差，游离荧光素干扰标记抗体浓度过高免疫荧光染色时间过长洗涤时间不够非特异性荧光消除用非免疫血清或10%牛血清白蛋白温育切片封闭非特异抗原位点动物肝粉吸收荧光抗体中非特异性成分层析或透析去除游离荧光素，纯化荧光抗体将抗体的浓度调整到高稀释度选择适合的切片方法封固剂、镜油必须无自发荧光用高渗盐浸洗，降低非特异性染色背景伊文氏蓝衬染法 |
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