第十七章流式细胞仪分析技术及应用第四节流式细胞术在免疫学检查中的应用一、淋巴细胞及其亚群的分析二、淋巴细胞功能分析
三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、AIDS病检测中的应用六、自身免疫性疾病
相关HLA抗原分析七、移植免疫中的应用FACSCaliburFACSAria流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强
度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进
行快速测量并可分类收集的高技术。由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色
受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞
处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形
器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），
FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）主要由计算机及其软件组成 前向散射光（forwardscatter,FS）：激
光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。
此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波
长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增
管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器荧光染料的特性分选速度：单位时间内分选
的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通
过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。
与分选速度成反比。参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散
点图）设门分析技术FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少单参数直方图
双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析由一维参数(散射
光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的
两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个
细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一
条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变
化率越大。多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。Gate设置
：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细
胞的分布情况。Region设置:区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对应，
但是也可以包含于门。第四节流式细胞仪免疫分析的技术要求样本制备标记染色液相芯片技术质量控制外周血淋巴细胞样品的
制备 分离单个核细胞培养细胞的样品制备蛋白酶消化机械吹打使贴壁细胞脱落 洗涤
尼龙网过滤新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法酶处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存深低温保存法（
一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）适用条件:有较高的量子产额和消光系数对488nm的激发光波长有
较强的吸收发射光波长与激发光波长间有较大的波长差易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 用化学法将两种不同激发波长的染
料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光
信号。荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标
记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片
技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经
激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。四、流式细胞免疫学技术的质量控制
适当的制备方式处理红细胞实体组织来源标本用机械法温度25~37℃，pH7.0~7.2温度pH染料浓度固定剂光路
与流路校正:确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准:保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度
工作状态。绝对计数校准:保证计数的准确性。同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置
电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第四节在免疫学检验中的应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可
区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T);T
c(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体,参与免疫调节、与自
身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析 NK(CD3-CD16
+CD56+)二、淋巴细胞功能分析细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例)细胞内细胞因子测定人外周血淋巴细胞亚群检测
四、肿瘤耐药基因分析六、自身免疫病相关HLA抗原分析七、移植免疫中的应用FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域
，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flowcytometrycr
oss-matching,FCXM）和群体反应性抗体（Panelreactiveantibody,PRA）检测。PE
CY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷5藻红蛋白能量传递复合染料机制（二）免疫荧光标记
三、免疫胶乳颗粒技术的应用微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液
相芯片则是用颜色来编码）通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析（一）单细胞悬液制备的质控（二）免疫
荧光染色的质控Flow-checkFlow-setFlow-count（三）仪器操作的质控（四）免疫检测的质控一、淋巴
细胞及其亚群的分析三、淋巴造血系统及白血病免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病
变T淋巴细胞T淋巴细胞检测淋巴细胞CD4+T（Th)淋巴细胞检测淋巴细胞CD4+CD8+Ts淋巴细胞检测淋巴
细胞CD8+CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示对化疗药物耐药五、AIDS病检测中的应用HLA-B
27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As)患者 三、荧光测量激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)
荧光补偿各荧光染料发射的荧光信号有重迭,因此要进行色补偿以除去重迭部分通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有
某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。四、细胞分选原理细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液
滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电（一）分选基本原理（二）分选的技术要求第二节数据的显示与分析
一、参数直分析方图设门分析:REGION和GATE设置二、数据显示方式（一）单参数直方图单参数直方图细胞相对数量
信道(channel)（二）双参数直方图1.双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度双参数直方图点图2.二维等高图
二维等高图3.假三维等高图（三）三参数直方图（四）流式细胞仪的多参数分析根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多
边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞A、B、C均为任意门线性门
D1CD4+/CD3-D2CD4+/CD3+D3CD4-/CD3-D4CD4-/CD3+如十字门分析时，起就可
以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。单细胞悬液一、免疫检测样品制备二、常用的荧光染料与标记染色FITCTe
xasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸荧光素得州红能量传递复
合染料藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料红670减少交叉，成本高不敏感易红670488PEcy5能量传递
复合染料633APC别藻青蛋白具较多发光基团，消光系数和量子产额高不敏感易488PC藻青蛋白橙
575488PE藻红蛋白稳定，偶联后量子产额低不敏感不易红615568Texasred得州红易溶于水，
与抗体结合不影响特异性敏感易绿525488FITC异硫氰酸荧光素特点对PH敏感性溶解性荧光颜色激发波长
染料名称常用的几类荧光染料能量传递复合染料减少补偿，荧光重叠第一节概述一、工作原理二、散射光的测定
三、荧光测量四、细胞分选原理第二节数据的显示与分析一、参数二、数据显示方式三、设门分析技术第三节
流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳颗粒的应用四、流式细胞免
疫学技术的质量控制思考题小结1934年，Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根
毛细管的细胞。1953年，Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。同年，Parker
和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。
1968年斯坦福大学研制出第一台以荧光活化的细胞筛选仪（Fluorescence-activatedcellsorter，F
ACS）。1973年BD公司以FACS的商品名称出品了第一台商业化的流式细胞仪，1975年美国BeckmanCoulter（B
C）公司研制出第一台带计算机的流式，进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善。随后，科学家们、仪器制造商们又纷
纷将研究焦点转向荧光染料的开发、细胞的制备方法和提高电子信号的处理能力上来。而今，流式细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个
分支领域，并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。流式细胞术(flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测
手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器
或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测
量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2
根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析临床型（台式机）科研型特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感
兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析第一节概述酶活性钙离子,PH值,膜电位激
素结合位点蛋白质含量胞内细胞因子DNA,RNA含量细胞活性粒度细胞表面/胞浆/核--特异性抗原大小细胞功能细胞
组成流式细胞仪常检测的细胞特性采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记
技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析
精确性。一、工作原理（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统1.流式细胞仪
的基本结构：（1）液流系统样本流SAMPLE单细胞悬液5105~1106个/ml喷嘴Fluorescencesig
nalsFocusedlaserbeam鞘液液流系统示意图FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管大多
数仪器是在50-300μm大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中（2）光学系统FlowTipLaserSSand
FLDetectorFSDetector光学系统示意图激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、高
强度的稳定光照。侧向散射光，荧光前向散射光（3）数据处理系统基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流
动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相
交形成稳态水平激光与之基本过程简单，单参数多参数，综合分析结果人工，200计算机，>5000统计目镜×物镜、光学放大PMT、放大电路放大方式形态及染色光学信号检测信号载玻片鞘液及流动室承载工具细胞、组织等细胞、生物粒子对象自然光、灯光激光光源显微镜流式细胞仪区别流式细胞仪与显微镜的区别细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。二、散射光的测定FALSSensorLaser前向散射光示意图 侧向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光示意图淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 |
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