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狭叶南五味子内生真菌分布的地点特异性 宋赫达
西南大学生命科学学院，重庆400715
摘要：狭叶南五味子(K. Angustifolia),为五味子科（Schisandraceae）南五味子属(Kadsura Juss), 是被子植物类的原始类群，属于被子植物离生心皮类。植物内生真菌是指那些其生活史的全部阶段或一定阶段生活于健康植物中细胞间隙或各种组织及器官内部的真菌或细菌，现在泛指一切生活在植物体内的共生、寄生和腐生真菌及细菌等微生物。内生真菌作为有开发潜力的生物防治资源，已经成为近年来研究开发的热点。 本论文探究西畴县和马关县两地的狭叶南五味子内生真菌的地点特异性。应用溶剂萃取法提取狭叶南五味子内生真菌的挥发油，经过几种柱色谱技术的分离纯化，从西畴县和马关县地区的狭叶南五味子的根中共提取出40个属的内生真菌，并且加以统计区分，发现其地点特异性。 关键词：狭叶南五味子，内生真菌，柱色谱分离技术，地点特异性。
The Site-specific features of Endophytic Fungi isolated from Kadsura angustifolia
Song Heda College of life science Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract：Kadsura angustifolia is the plant of Schisandraceae in the Kadsura Juss family. Known as a primitive group of angiosperms. A endophytic fungi refers to all fungi or bacteria that spend their whole life or a certain stage of their life in the gaps between healthy plant cells or in the inside of a variety of tissues and organs , now this term also generally refers to all fungi, bacteria and other microorganisms plants living inside plants in a symbiosis, parasitic or saprophytic way. As a resource of biological control with exploring potential, endophytic fungis have become a hot issue in research and development in recent years. This paper seeked to study the site-specific features of endophytic fungi in angustifolia Kadsura grown in the two places, Xichou and Maguan. This study used the means of solvent extraction to extract volatile oil of endophytic fungis in angustifolia Kadsura. After using the technology of several column chromatography to mske separation and purification , and extracting 40 generas of endophytic fungi from the roots of Kadsura angustifolia grown in Xichou and Maguan , and carring on and distinguishing the statistics, this paper found the site-specific features of endophytic fungi in angustifolia Kadsura. Keywords: Angustifolia, Kadsura endophyte, Column chromatography techniques, Site-specific features.
第一部分 文献综述 1.狭叶南五味子 狭叶南五味子(K. Angustifolia),为五味子科（Schisandraceae）南五味子属(Kadsura Juss), 是被子植物类的原始类群，属于被子植物离生心皮类。主要分布于亚洲东部到东南部，在我国南部到西南部大量存在。其种子形状为肾状扁球形，长约5.0-8.0mm，宽约4.0-8.2mm,厚约2.7-3.3mm；表面微皱，种脐为宽条形，长宽比为1/2；种皮纹饰为网纹型,网眼较浅，长方形或多边形；网脊龙骨状，较窄，约占网眼宽的1/3.本实验选用西畴县、马关县狭叶南五味子健康植株，分离其中的内生真菌，探究内生真菌分布的地点特异性[1]。 2.内生真菌 2.1内生真菌的定义 植物内生真菌是指那些其生活史的全部阶段或一定阶段生活于健康植物中细胞间隙或各种组织及器官内部的真菌或细菌，现在泛指一切生活在植物体内的共生、寄生和腐生真菌及细菌等微生物。内生真菌不是一个分类学单位,而是一个生态学概念。随着研究领域的不断拓宽,研究者把他们描述成与植物联合的特定的微生物类群,使得植物内生真菌的意义延伸至植物微病理学、植物生态学和生防等生物领域。大量调查研究表明,植物内生真菌的分布、种类、定植都因植物种类不同而存在差异。从现有的调查研究来看,植物内生细菌有革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性菌共约有50个属。大多数植物内生真菌属于子囊菌,包括核菌纲(Pyrenomyetes)、盘菌纲(Discomyetes)和腔菌纲(Loculoascomyetes)的许多种类以及它们的一些衍生菌,现已有80余属的几百种禾本科植物中发现有与之共生的内生真菌。内生真菌系统地分布于植物体的根、茎、叶、花、果实和种子等器官、组织细胞或细胞间隙。近几年来,已从黄瓜(Cucumissativus)、甘蓝(Brassicaoleracea)、花生(Archishypogaea)果仁、百慕大草(Bermuda grass)的茎及和其它植物储藏器官内分离到大量与之共存的内生真菌。宿主植物的叶鞘和种子中含有很多内生真菌菌丝,而在根和叶片中则含量极少。植物不同组织和器官相比较可以发现,不同的内生真菌占据着不同的生态位。植物体内不同的内生真菌相互作用,建立起一种生态平衡,其中有一些是数量大、分离频率高的优势种群,另一些则属于稀有种。在内生真菌与宿主植物经过长期的协同进化过程，二者逐渐形成了互利共生的关系。一方面，宿主植物的光合作用产物可为内生真菌提供营养物质；而另一方面，内生菌产生的代谢物常常包含一些抗菌、抗促生的活性物质，能够促进植物的生长发育，提高植物的抗逆、抗病害和抗胁迫能力[2]。 3.内生真茵与宿主植物之间相互关系 内生真菌大多可以对宿主的产量产生有益的影响。不但产生促生、抗菌的活性物质，而且很多植物内生真菌几乎可以在宿主植物的各种营养器官内发挥固氮作用。同时，内生菌还可以通过增强植物吸收氮、磷、钾等营养元素从而促进植物生长。有些内生真菌通过与植物互利共生，可明显增强植株的防病抗病能力，从而促进植株的生长。 目前的研究的主要方向集中在内生真菌对宿主植物的作用，但植物对内生真菌的调查研究较少。植物组织如果有特定的分泌物和充足的水分，则可以使内生菌黏附在一起从而在宿主内形成易于生存的生物薄膜结构，进而促进内生真菌的生长。由此可见，植物与内生菌之间是一种互惠互利的关系，两者的结合增强了各自的适应能力[3]。 3.1内生真菌在宿主植物中的分布特点 内生真菌在植物体中的分布具有普遍性、多样性的特点。在目前研究过的所有植物中均发现有内生真菌，它们存在于植物的根、茎、叶、花、果实等各个部位。各植物体中存在的内生真菌的数量、种类与植物的种类、生存环境、生长阶段、营养供给及两者的基因型有密切关系。不同地区、不同环境下生长的同一种植物组织中存在的内生菌种类和数目均有较大的差异，即使同一地区的同一植物不同组织部位中内生真菌的数量和种类也不相同。一般来说，生长在热带、亚热带地区的植物与生长在较干燥、寒冷环境下的植物相比，前者中内生真菌的数量种类多；生长速度快的植物比生长速度慢的植物中内生真菌数量多；生长时间长的植株比生长时间短的植株中内生真菌数量多[4]。 3.2内生真菌对植物的侵染特性 内生真菌可通过多种途径对宿主植物进行侵染。可以以内生菌体或孢子形式通过变形、吸器、或渗透等途径侵染植物。内生菌也可以通过分解植物表皮细胞壁或通过各种自然开口（包括侧根发生处，气孔，水孔等）或伤口（包括土壤对根的磨损，病虫对植物的损害及收割多年生植物造成的伤口等）等传播途经进入植物。孢子萌发、菌体生长繁殖和代谢等过程均受宿主植物的表型和基因型影响。且需要合适的温度、湿度、光照、地理位置、植被等环境条件及合适碳、氮等营养条件[5]。 3.3内生菌与宿主的互利共生关系 研究表明许多内生菌由于与宿主的长期共处，与后者形成互利的共生关系。一方面，宿主为内生菌提供充足的营养和适合的生长环境促进其生长。如Rudrappa等发现，植物组织内充足的水分及特定的分泌物产生，有利于微生物黏附在一起形成微生物在宿主内赖于生存的特殊结构——生物薄膜，进而促进内生菌的生长；易婷等报道，如宿主长时间处于各种逆境中，反过来也能大大提高生物薄膜中细菌的各种抗性及生存能力。 另一方面，内生菌在宿主应对外界环境的应激耐受性（包括抗旱、抗病虫害及对病原体拮抗等）、宿主植物的生长、宿主植物中的有效活性成分的产生等方面也产生重要影响[6]。 3.3.1增加宿主应激耐受性 宿主应激耐受性主要包括抗旱、耐热、抗病虫害及对病原体拮抗等。研究发现，即使不是所有，也应是大部分的内生真菌增加了其宿主的应激耐受性。至少有部分植物在没有内生真菌存在的情况下，因不能耐受居住地的各种生物或非生物的应激而无法生存。相反有大量证据证明内生真菌与植物的共生协助了早期植物在一些环境恶劣、贫瘠的土地上的生存。当植物感染内生真菌后，其针对某种应激的耐受性将大大加强，并能明显增加自身存活率。内生菌增加宿主应激耐受性的例子有很多，例如杜永吉等将来自于高羊茅的内生真菌Neotyphodium typhinum通过注射菌液法和菌丝塞入法回接至2种高羊茅宿主中，移栽后发现，含菌植株水分利用效率远高于不含菌植株，同时前者叶片相对含水量高于后者，具有更强保水、抗旱能力。 3.3.2 促进宿主的生长 内生菌与植物互利共生关系的一个重要体现就是能促进宿主的生长。Hashiba等和Narisawa等发现，感染内生真菌Heteroconium chaetospira的白菜苗干重可增加3倍左右。内生真菌促生作用的方式有多种，它们有的通过联合固氮来发挥促生作用；而有的则通过产生生长素、赤霉素以及细胞激动素等促植物生长物质来发挥其促生作用；有的甚至还可通过改变根部周围的环境来缓解植物根部的非生物压力，比如在对从向日葵根部分离出的一株根瘤菌研究时发现，其可以通过分泌胞外多糖来改变土壤结构，从而增加植物根部对环境的适应性，促进植物的生长。 3.3.3 促进宿主次生代谢物的产生 目前许多报道称，内生真菌可增加宿主次生代谢物的生成量。Mucciarelli等对薄荷无菌苗和感染内生真菌苗的挥发性物质进行比较，发现无论在空气中，还是在薄荷根、茎和叶片中，它们的含量均有显著差异，甚至在感染真菌的薄荷中发现有新的化合物存在[7]。 4.内生真菌的多样性及特异性 4.1内生真菌的多样性 最近二十年来人们才开始关注内生真菌并对其进行相关研究，所以说相对于其它类群的真菌而言我们还需进一步加强对内生真菌的认识和研究，从目前已经研究过的植物来看未发现没有分离到内生真菌的因此可以推断内生真菌在植物体内是普遍存在的[8]。 从不同植物体内分离到内生真菌种类的数量也不相同,少则十几种多则近百种.Fisher 等(1993)从Eucalyptus nitens 上分离到60 多种内生真菌,Hyde 等(1997) 通过对澳大利亚热带地区棕榈树内生真菌的全面研究，指出平均从每种棕榈树内分离到约100 种内生真菌造成这种差异的原因可能与植物种类本身所取样本的多少和样地周围的环境因子有关，虽然从植物组织中分离出大量的内生真菌类群，但是通过对内生真菌与宿主专一性分析平均每种宿主有4~5 种专性内生真菌，按地球目前已知25 万种植物计算，内生真菌总数可以超过100万种，可见自然界中存在大量的内生真菌资源急待我们去研究[9]。 4.1.1禾本科植物内生菌的多样性 已调查的内生真菌禾本科植物有80个属290多种，这些内生真菌主要集中在子囊菌门麦角菌科(Clavicipitaceae)瘤座菌族(tribe Balansiae)中的五个属：Balansia(无性型为Ephelis)、Balansiopsis、Atkin—sonella、Epichlo(无性型为Neotyphodium，过去称为Acremomum和Myriogenospora，种类约30个种，其中瘤座菌属(Balansia)是最大的属，有15—20个种，Sullivan等在禾本科植物上发现内生真菌一个新属。禾本科内生真菌是系统侵染且一年四季与植物共生[10]。 4.1.2非禾本科植物内生真菌的多样性 非禾本科植物内生真菌的物种多样性十分丰富。据不完全统计，已有内生真菌报道的非禾本科植物100多个属，200多种。 4.2内生真菌分布的地理特异性 同一种植物在不同的地理区域具有不同的内生真菌类群分布。Fisher 等1994 发现Quercusilex L. 叶子上的内生真菌类群在英格兰马略卡岛瑞士三地明显不同，蒲葵叶子上内生真菌类群在香港和百慕大两地也明显不同[12]。 4.3内生真菌分布的组织特异性 虽然在同一地区同一种植物上内生真菌类群是基本相似但是有的内生真菌在不同年龄植株和组织上的丰度和分布明显不同。 一般情况下随着树龄的增加植物内生真菌种类和丰度也随之增加，这主要是因为，一方面真菌通过空气和雨水传播可以使较长年龄的树有更多机会被真菌反复侵染，另一方面随着树龄增加，植株生理状况和树木表皮结构发生改变，从而使真菌更加容易侵入植物组织内[13]。 5.内生真菌的作用 内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化在演化过程中二者形成了互惠共生关系，一方面内生真菌可从宿主中吸收营养供自己生长需要，另一方面内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。 内生真菌可增强宿主的生长，在低水平氮源的土壤中，内生真菌可增加宿主对氮元素的吸收，如在侵染内生真菌的高羊茅的叶子中，氮元素的含量明显高于没有感染内生真菌的高羊茅[14]。 5.1内生真菌的药用活性成分 药用植物资源的利用具有悠久的历史，有记载的药用植物就有10000多种，其中大多数在其生活史中都伴随着内生真菌。我国学者对一些传统药用植物(如红豆杉、杜仲、滇重楼、半夏、葛根、天南星和麦冬等)等的内生真菌进行了深入研究，发现了许多药用活性成分。由于这些内生菌可以产生与宿主相同的活性物质，对药用植物内生真菌的研究和开发将在一定程度上缓解药用植物资源匮乏的现状。比如，在意大利的欧洲红豆杉中分离到一株北里孢菌能够产生紫杉醇[15]。 5.2植物生长发育调节活性物 植物内生真菌产生的许多活性物质对植物具有生长发育调节作用。它主要表现为对幼苗存活、种子发芽、花序形成、分蘖生长等方面的促进作用。研究表明，内生真菌对宿主植物的生长促进作用是由于内生菌能产生调节植物生长物质，从而间接影响植物的生长发育。这些物质包除各种植物激素如生长素、赤霉素和细胞激动素等，还包括其他物质。对从苦荞中分离得到的2株内生真菌提取物能诱导苦荞样品中苯丙氨酸氨解酶的活性升高，从而促进萌发[16]。 5.3内生真菌的实际应用 5.3.1在活性物质生产方面的应用 利用植物内生菌尤其药用植物内生菌生产高活性物质，已经取得丰硕的成果。今后，利用来源于民间草药的内生真菌生产新型天然活性物质是一个值得重视的途径。 5.3.2在经济作物种植方面的应用 内生菌在一定的浓度范围内可以影响宿主植物对外界环境、病毒、致病菌等的抗性反应。因此，利用内生菌植物间的相互作用，可以提高植物的抗逆性。 5.3.3在环境保护方面的应用 利用植物内生菌进行生物防治是现在研究的热点。它可以减少化学农药的使用，减轻环境污染。土壤重金属污染是当今面临的一个全球性环境问题。利用对重金属具有积累能力的内生真菌及植物共生体可为土壤重金属污染的植物修复提供可能。 5.3.4在卫生保健方面的应用 内生菌产生的活性物质除可以直接作为药用成分外，还可以作为添加剂改善产品从云南烤烟组织中分离出一株内生菌株。将其发酵液添加到成品烟叶中，发现烟叶中烟碱和亚硝酸盐含量都发生了变化。烟草叶片中的硝酸盐、亚硝酸盐正是烟草特有的强致癌物质亚硝胺的前体物[17]。 6.内生真菌的研究重点及展望 近二十年来虽然内生真菌的研究得到重视，并在内生真菌的入侵机理系统学生态学和资源开发方面开展了一系列研究工作，但是对很多问题还不是很清楚，缺乏全面系统的研究，而且绝大多数植物的内生真菌还没有被研究，迄今研究过的植物也不过数百种，这相对于目前自然界中存在的25 万种植物来讲是微不足道的，还有大量的工作需要进一步深入研究，以下几方面是现在内生真菌研究的重要领域。 1）内生真菌入侵宿主的分子机理，探测用内生真菌作为植物病害生物防治的研究； 2）内生真菌与宿主的关系及内生真菌在植物体内生命活动的分子调控研究； 3）内生真菌对宿主和组织的专一性机理分布等生态学问题； 4）内生真菌的分子检测和鉴定； 5）内生真菌在植物活力和环境污染检测方面的研究； 6）内生真菌产重要生物活性物质和酶的筛选； 7）在广泛的地理范围内对更多的植物进行内生真菌多样性的研究。 通过对植物内生真菌的全面系统地研究，一方面推动内生真菌的研究向更深入面方向发展，同时也丰富了真菌资源为真菌生物多样性研究做出贡献。目前虽然关于内生菌的研究很多，但在实际生产实践中的应用还不是很多，比如内生菌用于生物防治时，周围环境(土壤、植株表面及根际分泌物等)及植物体内部的微生态环境都对内生真菌的生长和作用的发挥存在着一定的影响(如拮抗或竞争等)，从而使得内生菌剂的防治效果不稳定，妨碍了内生真菌的应用。目前，对许多内生菌产的活性物质研究不完全清楚，难以得到较为纯净的有效成份。这也影响了内生真茵的实际应用。但从长远角度看，内生真菌的研究会给内生真菌的应用带来新的契机，必将给人类的生活带来更大的利益，具有重要和广阔的开发应用前景[18]。
第二部分 正文
本论文探究西畴县和马关县两地的狭叶南五味子内生真菌的地点特异性。从西畴县和马关县地区的狭叶南五味子的根中共提取出40个属的内生真菌，并且加以统计区分，发现其地点特异性。 1.实验材料 供试植物材料采自云南省西畴县、马关县，采样时，随机选取相隔一定距离的狭叶南五味子植株，样品标记后放于保鲜袋内，运送至实验室于4摄氏度保存在24小时内对样品进行处理。 2.培养基的配制 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，水1000 mL，pH 值自然。 配制方法：先将马铃薯去皮，切成小块煮沸 20 min，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后加水定容至 1000 mL。在将要使用时时加入 50 mg/L 氯霉素。 3.方法 3.1五味子根茎表面消毒 先用洗洁精将五味子根茎清洗干净，再用自来水冲洗3～4 次，尽量除去其表面附着的泥土和表面微生物。然后用超声波反复清洗直到清洗液极为清澈，再将根茎样本表面水分用滤纸吸干，按以下方法进行表面消毒： 1）采用 70 % 乙醇浸泡 1 min； 2）用10 %次氯酸钠浸泡5min； 3）加入75 %乙醇30 s； 4）用无菌水冲洗 3～4 次，置于滤纸上吸干水分。 (以上步骤均在超净工作台上进行)。 3.2消毒效果的检验 无菌水检验法：收集最后一次冲洗狭叶南五味子根茎的无菌水，涂布于培养基上作为对照，28 ℃下培养两周以检查狭叶南五味子根茎表面消毒是否彻底。 组织块印迹法：将表面消毒后的狭叶南五味子根茎在培养基上轻轻印迹，之后取出，将培养基在 28 ℃下培养 2 周，考察表面消毒效果。 3.3内生真菌的分离与纯化 1）取表面消毒后的狭叶南五味子根茎，然后用无菌刀片切成长、宽约 0.5 cm 的小块，接种至加有氯霉素( 50 mg /L)的 PDA 平板，置 28 ℃恒温培养。 2）定期观察内生真菌生长情况，当发现真菌菌丝生成后，通过尖端菌丝挑取法及时转接至新鲜 PDA 平板培养，重复挑取菌丝分离，直至为纯培养物。并将纯化得到的菌株编号。 3.4内生真菌的保存 内生真菌对于其生存环境的要较为特殊，某些菌株在离开宿主环境后很容易出现污染、衰退甚至死亡，为了尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不衰退、不被污染，必须尽快将其保藏。主要用以下方法进行菌种保藏。 (1) 斜面低温保藏法：一般选择 15 mm×150 mm 的试管，每管加入 5 mL 的固体培养基，灭菌后制成斜面。将待保藏的内生真菌接种于固体培养基斜面上，28 ℃培养 4~7 d。当菌丝长满整个斜面后，置于 4℃冷藏柜中保藏。此法操作简单方便，用于常用菌种的保存以方便转接，但保藏时间比较短，一般仅保藏半年。 (2) 冷冻保藏法：选取 2.0 mL 的冷冻管，每管加入 1.5 mL 的冷冻保存培养基。将待保藏内生真菌接种于培养基上培养两周后，挑取少量孢子(不产孢子的挑取一小块带培养基的菌块)转入含冷冻保存培养基的冷冻管中。先将其置于 4 ℃冷藏柜中 2 h，再转至-20 ℃冷冻柜保藏。此法用于菌种的长期保存，一般可保藏 5 年以上[19]。 4.内生真菌的形态观察和初步鉴定 内生真菌鉴定按照常规方法进行。挑取纯化的菌株尖端菌丝接种于 PDA 培养基上，培养一段时间以后按照以下方法观察菌落、菌丝体和孢子的形态结构特征并进行初步鉴定。 点植培养法：用接种针挑取少量孢子，点植于平板中央，倒置于恒温箱中，28 ℃培养 4、7、10 d，观察菌落特征。取少量菌丝，用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，再进行常规镜检。此法用于观察菌落及常规镜检。 插片法：将内生真菌接种置平板上，插上灭菌盖玻片，使真菌菌丝沿着盖玻片生长且附着在盖玻片上。培养一段时间后，取出盖玻片，置载玻片上直接观察。此法用于观察基内、外气生菌丝。 印片法：将待观察的菌落先印在盖玻片上，放置于滴有少量乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上直接观察。此法用于观察孢子及菌丝体形态。 制片检查：挑取纯化的菌株尖端菌丝接种于 PDA 培养基上，将灭菌的盖玻片45 度角插于固体培养基中，倒置放于恒温培养箱中 28 ℃下培养。每隔一天对菌株进行观察，观察菌落特征，记录菌落的形状、大小、色泽及变化，质地，生长速度，是否产生色素以及产生分生孢子体的能力；载片培养后的显微观察，观察菌丝特征(是否有隔，是否分枝，形状，颜色等)以及分生孢子体的特征，选取合适的插片，以乳酚棉蓝或蒸馏水为浮载剂制成玻片标本(乳酚棉蓝染色：插片用 0.1℅苯胺蓝染色 15 min 后，加入几滴乳酚油为浮载剂，在显微镜下观察。乳酚油加苯胺蓝是真菌标准的浮载剂。碱性染料苯胺蓝可染色真菌的原生质，而不染色细胞壁。乳酚油：水浴加热结晶的苯酚溶化 20 mL，甘油 40 mL，蒸馏水 2 mL)，然后在显微镜下观察菌丝体的粗细，分生孢子体的着生部位，形状、类型、大小等详细情况，产孢细胞的类型，形状，以及分生孢子的出芽方式，类型(单生还是多生)，是否有隔、大小、形状、表面特点，色泽等形态特征。根据《真菌鉴定手册》、《现代医学真菌鉴定手册》、《真菌的形态和分类》等应用常规方法进行初步鉴定[20]。 5.结果与分析 5.1狭叶南五味子内生真菌分离结果 采用表面消毒法对采集的狭叶南五味子根部、茎部进行处理，利用尖端菌丝法挑取纯化，总共得到256株真菌，其中西畴县84株，马关县172株（表1）。表1为鉴定出的内生真菌包括了4门（半知菌类、子囊菌门、接合菌门、担子菌门），36属，还有14株属于无孢菌群。其中星形菌属、长喙壳属、微球菌属、盾壳霉属、白单囊霉属、聚孢霉属、黑盘孢属、卵孢子菌属、峡串孢霉属、假裸囊菌属、芽霉菌属、枝梗边裂壳属、小孢霉属、圆酵母真菌只在马关县地区的狭叶南五味子植株中存在；而刺盘孢属、间座壳属、双足囊菌属、小辐射链孢霉属、单孢枝霉属、炭团菌属、葡萄穗霉属、栓菌属只在西畴县地区的狭叶南五味子植株中存在；其他菌种在两地均有分布。由此，可以说明内生真菌在宿主植株的分布具有普遍性和多样性的两大特点，同时，也可以表明了内生真菌在宿主植株中还有地点特异性的特点，即内生真菌的种类差异受到外界环境影响。 关于对照组，利用无菌水检测法和组织印迹法均未发现PDA培养基中有微生物生长，表明五味子根茎表面消毒测底，分离获得的真菌为内生微生物。结果揭示狭叶南五味子植物中内生真菌具有地点特异性。 狭叶南五味子根茎部内生真菌统计
5.内生真菌菌丝孢子部分显微图内生真菌菌丝孢子部分显微图
葡萄孢属 头孢霉属
峡串孢霉属 球孢霉属
小辐射链孢霉属 镰孢霉属 青霉属 简梗孢霉属
假裸囊菌属 轮枝霉属
1)葡萄孢属，分生孢子梗单枝以至树枝状分枝，顶端膨大或尖削，上有小突起；分生孢子单生于小突起上，球形、椭圆形或圆筒形，单细胞，无色或淡色。 2)头孢霉属，分生孢子梗从菌丝生出，直立，短小，顶端生球形或卵形的分生孢子；分生孢子相继断脱，由所分泌的胶状物质粘着成小球形，无色，单细胞。 3)峡串孢霉属，分生孢子圆形、椭圆形、卵圆形、长形或长方形，分生孢子梗不育部分明显，分枝，分生孢子间有隘小部分相连接。 4)球孢霉属，分生孢子几乎不存在；分生孢子不串生，至少不聚成头状。 5)小辐射链孢霉属，分生孢子梗分化明显；分生孢子暗色串生，有直立而与分生孢子梗相混杂的不孕菌丝。 6)镰孢霉属，分生孢子梗单生或集成分生孢子座，细长或粗短，单枝或分枝，或产生轮辐状排列的瓶形小梗。分生孢子无色，变异很大，常埋藏与胶质物内，有大小型2种：大型孢子多细胞，微弯或两端尖而弯曲显著，镰刀形；小型孢子多数单细胞，卵形或长圆形，单生或成串，间有2～3细构成的，长圆形。直或微弯。在培养基产生大量气菌丝成棉絮状，菌丝在培养基中常产生色素而呈红、紫、黄等色。 7)青霉属，菌落绿色、黄绿色、青绿色或灰绿色，有时无色至淡灰黄色、黄色或带红色或紫色；分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，分散或集成某种一定的形式，甚至聚成孢梗束，有横隔膜，光滑或粗糙，顶端生排列成帚状的间枝，分枝1次或多次，对称或不对称，顶层为小梗，以切离法生成分生孢子；分生孢子串呈不分枝的链状，单个孢子球形、卵圆形、椭圆形或洋梨形，光滑或粗糙，无色、绿色或带其他杂色。有些种产生菌核。有些种生成子囊世代。 8)简梗孢霉属，分生孢子单生，至少不聚成头状，分生孢子梗几乎不存在，分生孢子散生。 9)假裸囊菌属，包被菌丝壁厚与营养菌丝有显著的区别，子囊果球形，直径小于1/2毫米。 10)轮枝霉属，分生孢子梗直立，分枝，初次分枝两出、三出、或互生，二次分枝轮生，顶层小梗下部膨大而尖端细削；分生孢子单生，很快脱落，单细胞，球形、椭圆形、卵形或梭形，无色或略带褐色。 11)穗霉属，分生孢子梗分枝多，顶部生轮辐状排列而松散的小梗；分生孢子串生，球形、长圆形或梭形，无色或稍微着色。
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致谢： 本论文是在董瑾艳老师的悉心指导下完成的，从论文的选题、实验的设计和具体进行，以及最后文章的撰写，都凝聚了董老师无数的心血和辛劳，一直以来董老师严谨的治学态度、渊博的知识、对科研的奉献精神时刻鞭策着我。 感谢黄谦师姐在实验及论文写作过程中给我的所有帮助，是黄师姐在我做实验过程中给予全程指导，在此，衷心的对黄师姐说一声：谢谢师姐！师姐辛苦了！ 感谢沈师姐、毛师兄给我的帮助，感谢他们在实验过程中给我的理论和实践方面的指导，感谢他们不厌其烦地为我解答的所有疑问！ 感谢生科4楼所有师兄师姐以及一同做实验的同学给过我的帮助！ 在本论文的完成过程中，还得到了院领导以及我们班同学给予的大力帮助和支持，在此也表示我深深的谢意！ 最后，感谢我的辅导员唐婧老师和两位班主任王志坚老师和曾令刚老师，是三位老师在四年大学生活中给我无数的关心和指导，让我不断成长并始终向着自己的目标奋斗，在以后的研究生路上我不会忘记你们对我的鼓励和期望。
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