ESI和APCI的异同! ESI 为电喷雾,即样品先带电再喷雾,带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子,从而被检测,对于极性大的样品效果好一些; APCI 为大气压力化学电离源,样品先形成雾,然后电晕放电针对其放电,在高压电弧中,样品被电离,然后去溶剂化形成离子,最后检测,对极性小的样品效果较好。 ESI 的软电离程度较APCI 的还小,但其应用范围较APCI 的大,只有少部分ESI 做不出,可以用APCI 辅助解决问题,但是APCI还是不能解决所有ESI 解决不了的问题。 一般用ESI 和 APPI 搭配使用比 ESI 和APCI 的应用范围更广一些。 电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是分子量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,它适合于分析极性强的大分子有机化合物,如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样,一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000Da,进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点,目前采用电喷雾电离,可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是分子量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,它适合于分析极性强的大分子有机化合物,如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样,一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000Da,进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点,目前采用电喷雾电离,可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。 大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物。有些分析物由于结构和极性方面的原因,用ESI不能产生足够强的离子,可以采用APCI方式增加离子产率,可以认为APCI是ESI的补充。APCI主要产生的是单电荷离子,所以分析的化合物分子量一般小于1000Da。用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子,主要是准分子离子。 APCI与ESI源都能分析许多样品,而且灵敏度相似,很难说出哪一种更合适。同时至今没有一个确切的准则判断何时使用某一种电离方式更好。但是通常认为电喷雾有利于分析生物大分子及其它分子量大的化合物,而APCI更适合于分析极性较小的化合物。 APCI源不能生成一系列多电荷离子,所以不适合分析生物大分子。而ESI源由于它能产生一系列的多电荷离子,特别适合于蛋白质,多肽类的生物分子。 ESI和APCI共同点: APCI优点∶ 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR MS) 我们知道FT-ICR MS具有超高的分辨率和质量准确度,与其他质谱相比具有无与伦比的优势,但是其可控参数较多,调试比较复杂,要得到一副高质量的谱图,需要在仪器调试过程中下很大功夫,还需要对仪器的结构原理有较深入的了解。 以下是我在应用过程中的一些经验,我个人觉得以下几点很重要: 在调试过程必须要注意的几条规则: 1. 样品浓度要合适; 2.样品酸碱度要适当; 3.检测池中离子数目不能太多; 4.离子的能量要合适; 5.离子的累积时间并不是越长越好。 欢迎同行留言,相互交流! 网上在线免费化学物性、光谱和反应数据库 物性、质谱、晶体结构数据库 通过精确质量确定元素组成:从四极杆到傅立叶变换离子回旋共振质谱仪 利用质谱测定元素组成的方法已被广泛应用于各种领域研究,如:药物研发、药物代谢、环境研究、法医、食品安全、香精香料、兴奋剂以及天然产物等。传统的观念认为,要测定元素组成,必须获得高质量精度;而高质量精度只能从高分辨率质谱获得,如:TOF, Orbitrap 或者FT ICR MS。 最新的傅立叶变化离子回旋共振质谱仪(FT-ICR MS),其质量分辨率达到800,000:1,通过它可以得到<200 ppb的质量精度。但即使在如此高的质量精度下,仍然会存在好几个候选的化学式,必须依靠我们去选择和推断。 而在飞行时间质谱(TOF)上,典型的质量精度约为 5 ppm,通常候选的化学式有5~10个,加大了选择和推断的难度。 而且不幸的是,在所有上述情况下,正确的结果往往不是质量误差最小的候选化学式。所以仅仅依靠精测质量一个条件,不可能得到唯一可靠的化学式。但这些有着非常近似质量的候选者,由于元素组成不同而产生了不同的同位素分布,这个特点可用于进一步区分它们。 过去,研究者通过调节峰的宽度,来模拟和假定一个同位素高斯分布,试图用这个高斯峰形来区分上述的差异。但由于候选者彼此间同位素分布的差异极小(通常只有几个百分点),所以过去的方法常常是失败的,除非化合物中存在特征元素如Cl和Br。 为了区分同位素分布之间的微小差异,发展了一种综合的、同时包括质荷比(m/z)校正和更为重要的、峰形校正的方法,可以获取高精度的谱图,从而得到唯一的、正确的元素组成。而且,在低分辨的四极杆或者三重四极杆类型质谱仪上,也可用这种校正方法来获得唯一的化学式。 实验: 未知化合物(m/z=399 Da)和内标(m/z=410 Da,C28H60N+,精确质量410.4726 Da)混合,然后直接进样进入Waters Quattro三重四极杆质谱。用MassWorks软件进行质量轴和峰形的校正,得到1,517种可能的化学式。而排在第一位的C25H23N2OS+质谱准确度为99.44%。这个来自盲样分析样品的化学式在随后被合作者认为是正确的。 而同样的化合物,使用质量精度达到100 ppb的FT ICR质谱,仅仅以质量精度为条件搜索,会得到5个候选化学式,排在第一位的仍然是争取的C25H23N2OS+结果。 结论: 虽然质量精度在确定元素组成时非常重要,但即使使用高分辨率的FTMS质谱,如果仅仅应用质量精度一个条件,我们仍不能确定唯一的化学式。另一方面,对轮廓模式采集的质谱进行正确校正,以正确的同位素轮廓为基础,我们得到新的度量参数——谱图精度,它使我们即使使用单位分辨率的质谱,也可以获得唯一的、正确的化学式。 长期以来,由于生物样品的非挥发性、热不稳定性以及分子量大等特征,质谱的应用仅局限于对小分子的分析。但上世纪80年代的两项电离技术的发明:基质辅助激光解吸附(MALDI)和电喷雾(ESI)技术,使这一情况发生了戏剧性变化,同时也促进了质谱仪器的巨大发展,包括新的质量分析器的研发和各种多级的复杂的仪器的设计和组合层出不穷,如混合型四极杆飞行时间质谱(Q-Q-ToF)、串联飞行时间质谱(ToF-ToF)、混合型离子阱傅利叶变换离子回旋共振质谱(IT-FTICR)、轨道回旋共振Orbitrap质谱等。如今的质谱不仅可以对生物分子进行简单的质量测定,还可以对其分子结构、修饰位点和修饰种类进行测定。 生物质谱仪通常包括三个部分:离子源、质量分析器和检测器。质量分析器是质谱的核心元件,决定着生物质谱的灵敏度、分辨率、质量准确度和生成大量信息的碎片离子谱图的能力。 目前在生物质谱领域有四种基本的质量分析器:飞行时间、四极杆、离子阱和傅利叶变换离子回旋共振、Orbitrap,它们的设计和性能不尽相同,各有其优点和劣势。这些分析器可以独立使用,也可以串联使用以发挥各自的优点。 1. 质谱仪器的种类 1.1 四极杆(Q)质谱仪 四极杆质谱仪的质量分析器是由四根棒状的电极组成,两对电极中间施加交变射频场,在一定射频电压与射频频率下,只允许一定质量的离子通过四极杆分析器而达到检测器。四极杆质谱仪的突出优点是仪器结构简单,体积小,没有磁铁作分析器,所以没有磁滞效应,扫描响应速度快。其缺点是分辨率比较低。 四极杆质谱仪有多种组合类型,早期主要是单级四极杆质谱仪,该仪器与ESI或APCI离子源联用可以对分析物进行定性和定量分析。单级四极杆质谱仪依靠选择离子监控(SIM)方式完成定量分析,但是单级四极杆不能进行真正意义上的串级质谱分析(MS/MS),只能通过源内裂解模式得到部分碎片离子而实现类似MS/MS的功能。 多级四极杆的发展使四极杆质谱具有了强大的分析功能,可以实现所有的MS/MS扫描方式,包括子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描等。三级四极杆是目前普遍使用的四极杆质谱,第一级四极杆选母离子,第二级四极杆作为碰撞室对母离子进行碰撞解离,第三级四极杆作为质量分析器完成离子分析。三级四极杆采集到的MS/MS质谱图信息量大,并且较少发生重排反应,因而四极杆的质谱数据质量要高于离子阱串联质谱数据。 1.2飞行时间(ToF)质谱仪 对于飞行时间分析器,分析物的质荷比是根据分析物在真空飞行管中的飞行时间推算出的。飞行时间质谱的质量分析器由调制区、加速区、无场飞行空间和检测器等部分组成。样品分子电离以后,将离子加速并通过一个无场区,不同质量的离子具有不同的能量,通过无场区的飞行时间长短不同,可以依次被收集检测出来。早期的时间飞行质谱由于受飞行距离的限制,分辨率很低,近年来采用了一些调节离子飞行距离的离子光学系统和延迟技术,如各种离子反射透镜等,目前,飞行时间分析器的分辨率和质量精确度有了很大提高,一般的仪器的分辨率均可达到12000左右,质量准确度在经过严格的质量校正程序后可达到PPM级,而检测的离子质量范围达到几十万。 ToF质谱仪也经历了由单级向多级串联使用的发展历程。与四极杆质谱仪类似,单级ToF只具有简单的质量分析功能。不同的是,除了源内裂解外(当与MALDI联用时)离子在飞行过程中容易发生源后裂解(PSD)而产生亚稳离子,这种方式也能实现MS/MS分析的部分功能。ToF-ToF可能是目前应用最为广泛的质谱仪之一,其较快的图谱扫描速率(约100-200张图谱/秒)、高分辨率和高质量精确度极大地满足了 蛋白质组学研究中的各种需求。AB公司生产的ABI4700 MALDI ToF-ToF是这类质谱仪器的代表,该仪器由MALDI离子源、两级ToF、高能碰撞池、离子反射镜及检测器等部分组成,离子在MALDI源中产生并被加速和聚焦,对于MS模式可以直接由线性检测器检测。MS/MS模式下,通过第一级ToF选择母离子进入高能碰撞池中碰碎,然后进入第二级ToF重新被加速并被分析。最近AB公司又推出了功能更加完善的ABI4800系统,可以看作是4700的升级产品。相对于ABI4700,ABI4800采用了垂直立式设计离子光路更长;另外,对靶系统和激光系统也进行了改进采用了与MALDI靶完全垂直的激光光路设计。 1.3 离子阱质谱仪 离子阱质谱仪是一种串联质谱仪,在分析前先将离子聚集储存,离子阱是该仪器的核心部分,既可以作为碰撞室,又可以作为质量分析器。传统的离子阱(三维离子阱,即3D离子阱)由三个双面电极围成一个离子捕集室(一个环形电极,两个端盖电极),在环形电极射频电压的作用下,离子聚集在捕集室中心运动,在端盖电极上加电压可以选择出不同共振频率的离子进入检测器,也可以选择只有一种离子留在捕集室中,再用高速惰性气体碰撞诱导解离产生子离子,进行串联分析。离子阱可以储存所有从离子源进入阱中的离子,因此灵敏度极高。但同时,随着阱内离子数目的增加,空间电荷效应以及其他电场效应会导致被测离子频率的偏移,从而影响测量的准确度和分辨率,这种问题可以通过自动增益控制(AGC)设置控制进入离子阱的离子数量得以部分解决。线性离子阱(即2D离子阱)在3D离子阱基础上对离子阱的设计作了改进,使2D离子阱具有更大的离子容量和扫描速度。由此可见,离子阱的构造决定了离子阱只是一种中低分辨率的质谱,离子阱的优势在于,它具有非常强的离子储存和选择功能(RF电压扫描)。 1.4 离子回旋共振(ICR)质谱仪 傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)是质谱中十分重要的一类仪器,它是根据离子在磁场中会进行回旋运动的特性设计的。FTICR是一种具有超高分辨率和质量准确度的质谱仪器,其核心部分是由超导磁体组成的强磁场,和置于磁场中的ICR盒组成。FTICR因有超导体存在,必须在液氦的温度和超高真空的真空系统下工作,因此对环境的要求非常高。Obitrap质谱仪器是目前世界上质量精确度最高的仪器,可以达到亚PPM级,其核心部分是一个具有离子储存功能的C-Trap和质量分析器Obitrap。Obitap分析器由一个纺锤状电极组成。离子在高压射频作用下从从C-Trap注入Obitrap,在Obitrap中离子在磁场的作用下围绕中央的纺锤状电极震荡旋转,同时产生轴向的镜像电流,通过傅立叶转换后获得离子的质谱信号。C-Trap 除了具有储存离子功能外,还能起到静息离子的作用,因此可以有效消除离子空间电荷效应。Obitrap质谱仪器与FTICR质谱相比可以获得更高的质量精确度和分辨率,但是却不需要超导磁场环境,维护起来也更方便。 1. 5 混合型质谱仪 Q-ToF是由四极杆质谱和飞行时间质谱组成的串联型质谱仪,因此无论是在MS或MS/MS模式下均具有较高的分辨率和质量精确度。在MS模式下,四极杆具有离子导向作用;在MS/MS模式下,四极杆具有质量分选功能,第一级四极杆对母离子进行选择,离子的碰撞解离则在第二级四极杆中进行。装有反射器的飞行时间(TOF)分析装置与四极杆垂直配置,在MS和MS/MS状态下均有质量分析功能。在进行MS/MS质谱实验时,第一级四极杆质谱选取单一离子并将它送入碰撞活化室与惰性气体发生碰撞并使母离子发生诱导裂解,碰撞活化室由六极杆组成,在工作状态下四极杆上仅有射频电位,因而所有离子均能通过碰撞活化室,到达垂直飞行时间质谱的加速器中,在推斥极的作用下,离子进入TOF-MS进行质量分离,仪器的最终检测器为高敏感性的微通道板。由于此仪器配以电喷雾电离源(ESI)和基质辅助激光电离源(MALDI),可以分别实现与高效液相色谱联用或直接进样。为适应研究的需要进一步提高分辨率,此仪器装有多级反射器(W型),由于多级反射,其分辨率可达20000(FWHM)左右,Q-Tof可以进行多种模式的质量检测,主要包括MS Scan、TOF MS和TOF MS/ MS,这些模式同样可以用于负离子的检测。 Q-IT,即由四极杆和离子阱组成的混合型质谱。 例如,美国应用生物系统公司研制的QTRAP就是这一类仪器的代表。该质谱仪是将三重四极杆质谱仪(QqQ)中的最后一级四极杆(Q3)改为线性离子阱(LIT)设计而成,并可以通过电喷雾( ESI)和大气压化学电离(APCI)与HPLC 联用。其独特之处在于Q3 同时具有线性离子阱和传统四极杆的功能,且在离子阱模式下MS/MS的灵敏度比常规的三重四极杆型高出数十倍至数百倍,同时作为四极杆操作时保留传统三重四级杆型的扫描模式,可以选择子离子扫描(PROS),、母离子扫描( PRES),、中性丢失扫描(NLS),以及多反应监测或选择反应监测(MRM 或SRM),并且使全扫描方式的灵敏度提高。同时克服传统3D 离子阱的一些缺点,如低质量截止现象(1/ 3 效应)、碰撞效率低和定量分析性能较差等。因此,QTRAP的这种设计方式不但提高灵敏度而且也增加信息量,兼有定性和定量分析的功能,而且增加多种扫描功能和IDA ( Information Dependant Acquistion)等软件功能,使得QTRAP?型串联质谱仪很快在有机化合物结构分析、药物筛选及其代谢物定性及定量分析和蛋白分子研究等方面发挥独特作用。 QTRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪 现在主流的质谱技术是大气压化学电离质谱(API),包括APCI, ESI, APPI等,由于这些电离的技术比较新,相关的专著比较少。我看到一些书仅是简单的介绍了这些API的接口,很少有对这些接口下的裂解进行探讨的,而这样的研究现在主要来源于几本质谱学的杂志(RCM,JMS, JAMSS)。以API源作为接口的质谱,现在主要有离子阱,三重四级杆,TOF,LTQ等。离子阱有多级质谱(MSn)功能,是结构研究的强有力工具,LTQ(线形离子阱)也可以实现类似的功能,但现在这种仪器还不普及。我以后说的解析主要是针对离子阱质谱的! 关于离子阱质谱最好的书是Raymond E. March 和John F. J. Todd的Quadrupole Ion Trap Mass Spectrometry-Second Edition,这本书是讲离子阱理论最权威的了,只是里面太多的理论,当然学学这些对我们解析质谱还是很有帮助的,但假如没有很好的物理和数学基础,想看懂还是比较费尽的。 液相与质谱联用以后,与联用前比,增加的主要功能有哪些?液质在中药分析中哪方面应用最多? 你可以把质谱理解为一个检测器,就如常用的紫外检测器一样。 那我们想想,紫外检测器能提供什么信号呢?紫外检测器只能对那些在紫外区(一般为190-400 nm)有吸收的化合物有信号,也就是可以看到高出本底的色谱峰。这时候的信号仅能提供化合物相对量或者绝对量(需要标准物质)的信息,假如单波长紫外检测器改为DAD,那么这时候除了提供被分析物质量的信息以外,还能提供化合物的定性信息(特征吸收峰)。但DAD的紫外图谱作为定性的依据存在专署性差的问题(很明显,一张紫外图谱一般只有几个峰,并且都是很宽的峰,表示的信息当然很有限了)。 那么质谱作为检测器能提供什么信息? 1、定量信息 下面我们具体分析一下,从定量和定性两方面质谱到底优于紫外的有哪些地方: 接下来再看看定性方面,我们以离子阱为例(定性是离子阱的强项): 发了这么长时间,也没有人说个具体的问题,都是我在自己玩。可能作质谱的人比较少吧,搞研究的更少了吧,汗~~~~ 质谱的解析关键在于要有想象力,你看别人的文章后,往往有种感觉,为什么自己没有想到呢?假如你能想到,那你也可以发文章了。 明天我把刚做的一个样品的图谱放上来,让大家练习一下,解析的比较好的,还请斑竹多多鼓励。 刚才又看了上面发的那个生物碱解析的例子,不知道大家有没有人仔细看过,有没有看懂了? 上面解析的就没有问题吗?是不是还有别的可能? 还有最基本的,不知道大家会不会看多级质谱?那些标记代表什么意思?原始的图谱是怎样表示的,而写文章的时候又需要怎样表示? 我对质谱解析不怎么懂 一般分子的碎裂反应发生在高真空中,可以看成单分子的裂解反应;当然在离子阱中,离子浓度比较高的时候,还可以观测到双分子的反应。所以在解析质谱的时候,若遇到不能解释的情况,可以考虑是不是发生了双分子的反应。 做硕士时,我发现几个化合物的二级质谱图上可以观测到比母离子大14 Da的离子,当时很是奇怪,难道一个分子越碎裂质荷比越大吗?还是这是个干扰离子呢?经文献检索,也没有发现离子阱中可以生成这样的离子,并且只有含有羧基的化合物才会有这种反常的现象,在我们测试几个其它含有羧基的化合物中,大部分化合物观测到了这样的现象,但也有的化合物由于更易发生其它形式的裂解反应,没有观测到加14 Da的离子。 初步推测这种奇怪的现象可能与羧基有关!这些羧基化合物在正离子模式下,非常容易发生脱水反应(羟基上发生质子化),生成酰基正离子!另外我们发现生成的酰基正离子是与加14Da的离子经常共存,它们之间相差32Da,这提示我们可能是酰基正离子与溶剂中的甲醇反应,即分子离子反应!! 有了这个假设,剩下的只要设计实验证明就可以了。我们采用一个很简单的实验进行了证明,将样品溶解在乙醇中,然后再进行质谱分析,这时我们在化合物的二级质谱图中观测到了加2a的离子,也就是酰基正离子与乙醇发生了反应,这样的结果正好证明了我们前面的推测。 有机化学我以前很感兴趣,考研的时候看了很多高等有机的内容,也许这个对解析有点作用。我的经验是,解析是个综合性的过程,需要多面的知识,更需要经验,要不断地去尝试,去与有经验的人交流。 这是我刚做的一个化合物,给出了结构和多极图谱,希望各位联系一下,对图谱中的碎片进行归属 液质联用中常见质量差值(和分子量相比)和可能结构 正离子模式检测: 关于液质联用鉴定中药化学成分,我是按如下的思路进行的: 1 确定所研究中药的原植物来源,尽可能把该植物已知的化学成分的结构、质谱数据、UV数据收集完全。必要时收集整个属的化学成分的相关数据。 2进行LC-MS正负离子切换一级质谱检测。目的:确定分子量。仅靠一种离子模式检测确定分子量并不是很可靠,除非在正离子模式下同时观察到[M+H]+,[M+Na],[M+K]+峰。根据依次相差22,16可以确定分子量。 3结合DAD所得紫外图谱特征,确定化合物大概类型。 4进行多级质谱检测,根据裂解碎片,确定分子中可能含有的碎片,结合分子量和生源,如果是已知化合物的话,至此基本可以归属化合物。当然,立体异构体还无法归属。比如苷中糖的连接位置,甲基的取代位置还是很难确定的。 5如果能做LC-TOF-MS,或者其它高分辨率MS,得到分子式的话就更好了。 6必要的时候对于立体异构体采用反应质谱法试一试。 7根据初步鉴定结果,购买可能的化合物标准品,进行对照实验。 一点感想: 根据我自己的理解,对你的解析提出一些建议,不当之处还请海涵。 一点感想:
你对新知识的渴求和用于探索的精神还是很值得我们学习的,比那些不敢尝试的人强多了。根据我自己的理解,对你的解析提出一些建议,不当之处还请海涵。 1、“逆DA裂解”,我想你已经指的是RDA裂解,假如是的话,直接用RDA表示更符合习惯些; cooks兄的讲解挺有道理,我对这块的确是个新手,只是以前有过分析化学中ei解谱的基础,所以昨天大胆的在这里瞎闹 楼主的帖子讲的很有道理,LC-MS作定性我没试过,想请教楼主对于样品中的杂质,如果ESI响应一般,要用LC-MS作结构解析含量至少要多高,比如0.01%能做吗(假设溶液浓度是10mg/ml)? mingzuo wrote: 这个具体的量根据化合物而异,只要这个化合物的响应足够得到化合物的多级质谱就可以了。你说的0.01%或者更低,都有可能采集到多级质谱信号。 但我们需要明白,一个未知化合物能不能最终鉴定结构,有时候仅仅是通过多级质谱还是不够的。你可以把你的样品信息贴上来,给你具体分析一下。 质谱解析关键在于多练习,孰能生巧。 下面是这几天刚做的一个样品,大家先练练手。 (缩略图,点击图片链接看原图) anastrozole这个化合物的结构中存在对称,它在MSn主要发生失去苯环的周边基团的反应,它的多级质谱关键是MS3,只要弄清了MS3中主要碎片之间的关系,所有的图谱就一通百通了。下图指出了这些碎片间可能存在的关系: 根据上图所指明的关系,我们可以得到这个化合物的所有主要碎片的解析: (缩略图,点击图片链接看原图) 再发一个难点的例子: (缩略图,点击图片链接看原图) 我不懂,但是请问核磁共振(NMR)在检测中的作用有多大?谢谢指教. 请问有没有碰到过,出现M+H 峰的同时还有M+H+2 峰的情况?这个M+H+2 峰 是什么? |
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