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卫生学检验： 微生物限度 1. 包装材料的大肠埃希菌检查? 答：根据包装材料的不同，大肠埃希菌的检查方法大致有两种，一种是将浸提液合并后，取一部分，接种胆盐乳糖培养基进行检查;另一种是将浸提液合并后，薄膜过滤，然后按规定的方法检验。 2. 抗真菌药品的微生物限度检查法 答：这类产品的霉菌和酵母菌计数方法需要进行调整，可以根据产品剂型的不同，选择薄膜过滤法或培养基稀释法等方法。 3. 为什么在日常样品检测中还需要做阳性对照(国外不需要)? 答：为了确保每一次检测对可能存在的微生物都是有效的。 4. 对于同一个品种，药典为什么不规定统一的检测方法? 答：本版药典进行过这样的尝试，也有某些品种已经收载了统一的检测方法，如注射用头孢类抗生素的无菌检查。之所以没有大量收载，主要是由于检测方法还没有经过必要的复核。将微生物检验的统一方法收载在品种的各论项下，始终是努力的方向。 5. 梭菌检查中需置厌氧条件下培养48小时，是否指在厌氧培养箱中? 答：需要在厌氧培养装置中进行培养，未必一定是厌氧培养箱。 6. 控制菌检查方法验证时，采用多种方法均未检出控制菌，如何处理? 答：在确保所使用的各种方法都没有错误的情况下，如果仍无法使试验菌生长，则应该采用薄膜过滤法进行检查。理由是该方法能够最大程度地去除产品的抑菌作用。
 7. 常规的监督抽样检品(包括原料)在进行微生物限度检查时，是否一定要进行活螨检查并在原始记录与报告书中体现? 答：需要进行检查。可以在原始记录中体现，报告书上可以不出现，除非当发现有活螨检出。 8. 药包材微生物限度检查规定了合格质量水平，通常产量下取样8个，要求8个瓶子均符合规定，如何进行? 答：每个瓶子分别进行实验。 9. 大肠埃希菌具体操作规程? 答：参见中国药品检验标准操作规程。 10. 动物组织及动物类原药材的提取物入药，是否需要检沙门菌? 答：需要进行沙门菌检查。 11. 关于中国药典菌落计数结果的判断还存在疑义，望能举例说明。 答：不清楚所指的存在疑义是指哪方面。2010年版对结果报告进行了较大篇幅的修订，目前的规定应该比05版更为清晰、明确。 12. 需做沙门菌检验样品量的确定? 答：10g(ml)用于样品计数检验和其他控制菌检查，10g(ml)用于沙门菌检查，10g(ml)用于沙门菌检查的阳性对照。需要进行沙门菌检查的样品，检验用量应为30g(ml)。 13. 日常的实验室装备能否达到梭菌无氧的培养要求? 答：完全可以。可以采用厌氧培养盒(罐)。 14. 如果一个产品有两个规格，是否可以取其中之一做阳性对照? 答：每个规格均需进行阳性对照。 15. 细菌数为100g/g的，样品稀释级只做1:10,1:100的倍数就可以了吗? 答：可以。 16. 培养时间3天，5天，可理解为72小时，120小时吗? 答：可以。这样更为严谨。 17. 中国药品检验标准操作规范“已做验证试验的供试品，在检查时刻不必再做阳性对照”如何理解? 答：该标准操作规范中在无菌检查法中规定“供试品无菌检查应进行阳性对照试验”，表明不论是否进行了方法验证，在产品的每一次检验过程中，还必须进行阳性对照。在控制菌检查的大肠埃希菌项下，指出“已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再作阳性对照”。该规定仅适用方法验证与供试品检查同时开展的情况。2005年版药典，2010年版药典和2015年版药典在控制菌检查中均对阳性对照试验有明确规定，“进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。”产品检验中应以药典规定为准。
 18. 无菌检查和微生物限度检查中，产品中规定的溶解液是否可以换成其他的溶液? 答：可以。 19. 制剂通则中，没有微生物检查项目的，是否可不进行微生物项目检测? 答：可以。主要是二部制剂通则中口服片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。 20. 在细菌、霉菌和酵母菌计数中，适用性检查细菌是培养48小时，霉菌和酵母菌是培养72小时，供试品检查中细菌是培养3天，霉菌和酵母菌是培养5天，那方法验证中应参照哪个时间进行培养。 答：应按照供试品检验时的条件，即细菌3天，霉菌和酵母菌5天。 21. 测定纯化水微生物限度时，每张滤膜过滤量是多少合适?需要先稀释吗?过滤完后需不需要冲洗?假如我取10ml纯化水通过双杯体封闭式薄膜过滤器过滤，每张滤膜上的计数是以5ml为单位还是10ml为单位? 答：过滤量应以培养后出现的微生物数不超过100cfu/膜为标准。一般可不稀释。不需要冲洗。每张滤膜的过滤量为5ml。 22. 2010药典中关于纯化水的微生物限度是：细菌、霉菌及酵母菌总数每1ml不得过100个。这句话的意思是细菌总数每1ml不得过100个，霉菌及酵母菌总数不得过100个，还是细菌+霉菌+酵母菌总数每1ml不得过100个。如果是三者总数的话，那细菌总数限度是多少?霉菌及酵母菌总数限度又是多少? 答：是总数不得过100个。没有必要考虑各自的限度值。 无菌： 1. 应用已验证合格的灭菌程序对培养基进行灭菌，还需要每批做无菌性检查吗?如何理解“每批”? 答：需要。是指每一个配制批。 2. 新增0.5%葡糖糖肉汤培养基(用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查)此句应如何理解? 答：该培养基并不是新增的。专用于检验链霉素依赖型细菌。 3. 无菌检查每片滤膜总冲洗量不能超过1000ml，是否包括稀释液? 答：不包括。 4. 稳定性考察做无菌检查项时，留样量是否同时考虑检验损耗和重试数量?若要重试，无菌检查时限较长，结果是否可信? 答：理论上讲需要考虑重试数量。真需要重试时，重试时刻会比稳定性考察规定的时间点略迟，这种时间差是由于无菌检查法实验设计造成的，结果当然可信。 5. 通常无菌检查在进行样品检验的同时，除进行沉降菌检测外，是否一定要同时进行其他项目的采样? 答：按照2010年版药典的规定，日常检验需对环境进行监控。从环境监控的范围分析，仅仅只进行沉降菌监控是不够的。 6. 在做日常无菌检查时要求进行环境监控，从哪些方面监控? 答：主要包括：空气中的微生物、表面微生物(包括人体、物品、仪器设备、耗材等)和消毒剂中的微生物。 7. 在新版的药典中提出了阳性对照管需生长良好是判断结果的前提，着重强调了阳性对照试验。阳性对照是每批培养基做一个，还是每次实验做一个?药典方法上说每批无菌检查都要做阳性对照，但我在好多资料上看到只要是同品种、不同批次，在同一天做的就可以只做一批的阳性对照，但这到底可行吗? 答：无菌检查中的阳性对照应该是每一批样品都要进行的。 方法验证： 1. 做过验证的样品微生物检验方法是否都需要按照新的方法进行重新验证? 答：对于微生物限度检查的产品而言，由于培养时间调整，应重新进行验证。对于无菌检查的产品而言，如果方法未作实质性调整，可以不必重新验证。个别产品在各论中收载了新的无菌检查方法，对这些品种，应对收载方法的适用性进行验证。 2. 以前做过无菌验证的品种是否需要重新按照新的标准再验证? 答：参见问题1。 3. “新增抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜” 比如注射用克林霉素磷酸酯属于抗生素，是否需要重新选取滤膜再验证? 答：目前采用的方法如果经验证表明可行，则可以继续使用该方法。 4. 微生物方法学验证时，培养时间是否跟样品日常检验所培养时间一致? 答：应该一致。 5. 微生物限度验证时，如果一个方法只有金葡回收率达不到要求，该方法时是否可以用来做细菌霉菌的检测方法? 答：按药典的规定，一个计数方法通过验证，是指所有试验菌的回收率均达到要求。如果采用各种方法以及方法的组合仍无法使金葡回收率达标，则可以采用使金葡回收率最高的方法作为计数方法。 6. 薄膜过滤的冲洗量不能超过1000ml，我公司的喹诺酮类产品原来的方法是每张膜冲洗量为1500和2000ml，请问有没有合适的方法将冲洗量降至1000，各菌的回收率仍能符合规定? 答：有几种办法可以降低冲洗剂的用量：1)降低接触滤膜的供试品的浓度;2)改进冲洗的方式，如少量多次地冲洗、降低蠕动泵的转速等;3)添加中和剂，如高价金属离子。 7. 微生物限度检查法规定，技术方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品检验。请问，上述方法是指仅通过一种方法还是一定要通过几种方法联用的? 答：应该要把可能采用的所有方法包括方法联用都进行验证。 8. 供试品不溶于稀释剂，同时又有抑菌性，限度检查时应如何消除抑菌性? 答：采用低速离心的方式，尽可能把供试品去除干净，取离心后的上层液，进行薄膜过滤。 9. 不溶于水的固体产品，加表面活性剂后，如何操作才能在方法验证中得到较好的回收率? 答：同问题8。 10. 有些品种2010年药典与2005年比较检验方法变了，是否需要验证或确认? 答：同问题1。 菌种管理： 1. 浓菌液的有效期该如何确定? 答：药典没有规定。可以通过实验确定有效期。例如，在不同的时间点测定浓菌液的浓度，从而判断其有效期。 2. 药典要求菌液在制备后2小时内使用，若保存在2-8℃的菌悬液可在在24小时内使用，那我们在做验证或阳性对照是要加一定量的菌就没有时间进行平板计数了，该如何确保所加菌量准确? 答：药典对稀释菌液的使用期限作出规定，并不会影响操作过程中稀释菌液的加入。即便不规定，也无法在准确知道菌液浓度的情况下加入试验菌。菌液稀释的实验操作和加入菌液的实验操作应该是在同一次实验中完成的，要使加入的菌量符合药典的规定，可以从浓菌液的制备方法、菌液稀释的方法等方面进行规范，也可以引入浊度比较的方法。 3. 菌悬液能否在倒平板之前确定菌含量? 答：活菌含量是无法确定的。总菌量可以通过比浊的方式确定。 4. 具体从哪些方面进行菌种菌株的特性和纯度确认?如何操作? 答：基层的微生物实验室进行菌种纯度确认可以考虑以下一些方面：1)形态学鉴定，包括菌落形态和染色形态;2)生化鉴定，可以考虑使用API鉴定系统。 5. 黑曲霉冻干菌种如何转种，传代? 答：与其他菌种一样，所不同的是使用的培养基应改为改良马丁琼脂培养基。 6. 干粉状的是否可做第0代使用? 答：只要是菌种保藏机构提供的冻干保藏的菌种，可以确定为第0代。 7. 菌种每次传代都要做纯度、特性等的确认吗? 答：从外部购入的菌种，在进入本实验室的菌种保藏体系时，需要进行纯度和特性的确认。以后的每次传代，可以通过显色培养基做简单的确认即可。 8. 如采用低温保存菌种，需购买哪些设备?能够到省所进行实际操作培训? 答：低温冰箱，应能够提供-70℃的低温。可以到省所来培训。 9. 做方法验证时，工作用菌种能否同时操作，如何防止交叉污染? 答：可以同时操作。避免交叉污染的关键是无菌操作技术。 10. 是否等菌悬液的含菌数出结果后再做适用性等检查? 答：没有必要。可参见问题2。 11. 菌液制备中菌液是否都要验证储存期? 答：稀释菌液可参考药典规定。如要保存浓菌液，则需要验证有效期。 12. 菌种CMCC是否可以用ATCC替代，从省所或中检所购买的菌种是否每次都可以出具规范的COA? 答：中国药典使用CMCC的菌种，并没有规定可以使用其他等效的菌种。省所提供的菌种严格讲属于标准贮备菌种，无法提供ATCC这样的COA。CMCC至今也无法提供这类证明。 13. 铜绿假单胞如何保藏? 答：可以使用低温冷冻保存的方法。 14. 工作用菌液是否属于亚培养或传代一次? 答：工作用菌液应属于一次传代。 培养基质控： 1. 计数培养基的适用性检查是否只验证营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基?使用的干燥成品培养基(脱水培养基)的验证是否有培养基厂家在做?培养基的验证时按批号分批验证吗? 答：计数培养基不仅仅只有这两个培养基，还包括酵母菌计数用培养基。培养基生产厂家在出厂检验时，会进行质量检验，但并不一定符合药典的要求。对实验室使用的培养基进行质量控制，可参见药品微生物实验室规范指导原则的有关规定。该指导原则指出，当培养基的配制方法和灭菌方法都进行过验证并严格按验证的方法执行时，培养基的质量控制对每一批干燥培养基而言只需进行一次。“除药典附录另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。” 2. 对照培养基在哪里购买? 答：广东环凯。 3. 如何准确方便的控制培养基的PH值? 答：在灭菌前测定和调节培养基的pH值。 4. 由环凯的培养基是否还需要做培养基适用性检查?培养基(已灭菌)在冰箱储存期有多久?二星期内用可以吗? 答：不论是何企业生产的培养基，必须进行适用性检查。指导原则建议的保存期：“培养基灭菌后若储藏在高压灭菌器中，质量可能会受影响，一般不提倡这种存放法。琼脂培养基不得在0℃或0℃以下存放，因为冷冻可能破坏凝胶特性。培养基应避光保存，若要长期保存，应置于密闭容器中以防止水分流失。琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般不超过一周，且应密闭包装，若延长保存，保存期需经验证确定。” 5. 培养基在灭菌后测其PH值，像营养琼脂在冷却到室温25℃时已经凝结，该如何测定? 答：在灭菌前测定何调节pH值。 6. 培养基适用性检查中，五种菌液是否都要制备使用? 答：计数培养基的适用性检查五种试验菌均应使用。 7. 厂家已做过适用性检查的，是否还需进行适用性检查? 答：厂家的适用性检查不能代表某个特定的实验室，实验室在购入培养基后，应根据本实验室的配制和灭菌方法进行适用性检查。 8. 培养基的有效期一般可以控制在多长时间? 答：无菌检查的培养基贮存期限可参见药典规定。微生物限度检查的培养基，应对保存期进行验证。 9. 控制菌检查用培养基要做促生产能力，控制能力及指示能力检查，细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基是否也要做这类检查? 答：按照药典规定进行。计数培养基有其特定的检查方法，采用回收率比较的方法进行评价。 10. 环境监控所用培养基均进行预培养，培养时间如何确定? 答：没有统一的规定。 11. 控制菌用培养基都需要进行适用性检查吗? 答：需要进行适用性检查。效价、抑菌效力： 1. 阿奇霉素用高效液相法测定，而成品注射用阿奇霉素枸橼酸二氢钠为什么还用效价法测定? 答：阿奇霉素在2010年版药典中，含量测定的方法修改为HPLC法，但是许多注册标准没有及时提出修订，就存在部分制剂还在执行注册标准中的含量测定方法-效价测定。建议这部分企业尽快根据原料标准的变化情况，开展相关制剂含量和有关物质检查的方法学研究工作，并及时提出标准修订的补充申请。 2. 老产品是否也需要做抑菌剂效力检查? 答：药典凡例、制剂通则和各论中都还没有规定必须进行抑菌剂效力检查。 3. 效价的平均可信限率PT的FL%〈5%达不到。 答：药典规定的就必须要达到。应该分析原因，改进操作技术。某些产品特别是氨基糖苷类抗生素，可信限率的确很难达到，药典对个别产品是允许提高到7%的。 实验室验证体系： 1. 药典要求(培养基)配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌，是否可以按照培养基说明说书上的方式进行灭菌而不用进行验证?如需验证，是否每种培养基都至少要做三批?高压灭菌器的蒸汽循环系统的验证该怎么做? 答：培养基说明书上的灭菌方法仅仅只是供应商推荐的方法，不同的实验室应对选定的灭菌程序经过验证。每种培养基至少要做多少批没有明确的规定。蒸汽循环系统的验证应考虑热分布、热穿透和生物挑战性实验结果。 2. 消毒液有效期的验证等微生物实验室的支持验证体系能否详细的讲解一下? 答：消毒液有效期验证可参见消毒技术规范(2008)。其他微生物实验室支持系统的验证涉及的内容较多，拟考虑设专题讨论。 |
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