2014/May
华联生物科技www.onearray.com.cn1
2001年Ambros实验室
与Bartel和Tuschl实验
室在《Science》杂志上同时
发表了miRNA论文，发现了
一系列miRNA，从此miRNA
研究在全球如火如荼地开展
起来。
TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmall
RNAswithantisensecomplementaritytolin-
14.Cell,1993
1993年，miRNA领域的
开拓者Ambros教授在线
虫中发现了第一个miRNA，
lin-4.
BreakthroughdiscoveriesinmiRNAbiologywithaspecial
focusonthecardiovascular?eld
2011,108:219-234CirculationResearch
MicroRNAs（mRNA-interferingcomplementaryRNA）
来源：真核生物中发现，内源性的，具有调控功能的非编码RNA，大
小长约20~25个核苷酸，经过一系列加工得到成熟的miRNAs
作用方式：通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA或DNA
作用结果：主要调节基因的表达，发育，增殖，分化和凋亡
版本更新：当前的SangermiRBaseRelease已升级为20.0，包含有206
物种，24,521个发夹序列和30,424成熟序列。
?21–25nt,intrinsic,
non-codingsmallRNA
?locateinintron/exon
?SangermiRBase
?5’and3’maturemiRNA
(5p&3p)
?Highlyconservation
?family/cluster
miRNA通常存在于基因的内含子区域〃miRNA的合成先后在细
胞核和细胞质中进行〃
细胞核中的miRNA基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录出初
级miRNA(pri-miRNA)
被RNA聚合酶Ⅲ(Drosha酶)及其协同因子(DGCR8)组成的酶复
合，体剪切为具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA)
随后被转运蛋白5(exportin-5，Expt〃5)识别并结合，依赖
一种小GTP结合蛋白(ran-GTP)将其转运至细胞质
在胞质中，pre-miRNA被同属RNA酶Ⅲ家族的Dicer酶，
在TRBP(TarRNAbindingproteins)和
AGO2(Argonaute2)的协助下处理成长度约22nt的双链
RNA(miRNA:miRNA〃
在解旋酶的作用下，其中1条链(miRNA)很快被降解，
另1条链则进入RNA诱导沉默复合体(RNA-induced
silencingcomplex，RISC)，成为成熟的miRNA
1）二者不完全互补：即二者不完全配对结合时，主要影响翻译过程，而对
mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-4
2）二者完全互补：即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的
结合，特异性的切割mRNA，如miR-39/miR-171
3）上述两种模式均具备：当其与靶mRNA完全互补配对时，
直接靶向切割mRNA，如let-7果蝇/线虫
大多数miRNA基于部分互补
抑制基因表达，一个miRNA
能靶向多个mRNA，而多个
miRNA也可作用于同一个
mRNA，在多种组织和细胞中
协同调控基因的表达
Overall,98of186(52.5%)of
miRgenesareincancer-
associatedgenomicregions
orinfragilesites
ProcNatlAcadSciUSA.Mar2,2004;101(9):2999–
3004.
功能验证筛选发现
13
NGSmicroarray
NGS
qPCR
microarray
over/down-expression
target(Reporter)
芯片(microarray)用于筛选差异miRNA三个优势–
?数据简单、直观
?可验证率高
?服务周期短
Increasetargetprotein
orreporterexpression
IntroduceprecursormiRNAs
(Pre-miR)
Reducetargetprotein
orreporterexpression
TargetgeneIdentification
Genefunction
Cellularprocess
Phenotype
Loss-of-functionexperiment
IntroducemiRNAinhibitors
(Anti-miR)
Gain-of-functionexperiment
Culturedcells
测序
芯片
qpcr
miRNA的模拟/抑制
miRNA的荧光素酶
报告基因载体
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HumanMouse&RatModelPlants
miRNAOneArray?产品包含人(human)、大鼠及小鼠(Mouse&Rat)及模式植物miRNA芯片
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MPmiOAv3探针设计包含水稻、短柄草、大豆、阿拉伯芥、高粱、葡萄和玉米七种常见的模式植物与经济作物
http://www.onearray.com.cn/Products/MPmiOA_Probe.php
芯片miRNA基因探针控制探针miRNA对应基因数探针重复数数据库版本
HmiOAv6
HumanmiRNA
OneArray?
2,5391442,5793SangermiRBase20
MRmiOAv5
Mouse&RatmiRNA
OneArray?
1,506144
Mouse
1,265
Rat
722
3SangermiRBase19
MPmiOAv3
ModelPlantsmiRNA
OneArray?
1,0181171,8173SangermiRBase17
常用物种包含SangermiRBase19/20版数据库信息
MRmiOAv6对应的基因数：小鼠(1908)，大鼠(728)
控制探针类型中文名称功能描述
GAM矩阵校准标记芯片的定位校正
Positive
ControlProbes阳性探针
包含共13个小RNA基因,主要以snoRNA如
U6等作为内部阳性探针监测样品RNA标记与
杂交效率
Negative
ControlProbes阴性探针
设计不与样本RNA杂交的序列,可作为阴性控
制探针,或利用外加的合成序列(spike-ins)进
行实验流程的管控。
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与实验品管相关的探针,于探针编码时,以PH_mrc开头。
http://www.onearray.com.cn/Support/HmiOA_CP.php
阳性控制探针
阴性控制探针
阴性控制探针加入spike-ins
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22
?包含更新且完整的SangermiRBasemiRNA信息
?探针设计把关Tm值并避免二级结构干扰
?运用非接触式快速布点技术，布放三重复的探针
?自动化生产流程及质量检测，达到良好的平台稳定性，适用于差异基因筛选
?搭配不同杂交技术，可进行细胞、组织、FFPE样本、冷冻包埋样本、血清
、尿液样本来源的RNA
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ProductSpec.
ProbeContentSangermiRBaser19
ProbeSequenceTmequilibrium／2ndstructurereview
ProbeReplicate3
Spot-to-spotCV<15%
reproducibilityR~0.99betweentechnicalreplicates
Sensitivity10attomole
DynamicRange4order
SpecificityPM/2MM~5fold
RNAinput0.5-2.5ugtotalRNA20-200ngsmallRNA
PrecisionR~0.8comparedwithreal-timeqPCR
稳定性
专一性
灵敏度
跨平台可验证率
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?自总RNA(totalRNA)起执行芯片服务，亦能接收小RNA片段进行芯片实验
?抽提血清样本中miRNA经验丰富
?单光系统及一芯片一样本的设计，实验设计更加弹性自由
?提供技术重复选择，降低假阳性概率
?提供表达谱数据与miRNA芯片数据整合分析服务及可视化呈现
RNA抽
提质检
小RNA
富集
芯片实
验
差异基因
产出
数据均一
化及比对
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去除長片段RNA
Cy5moleculeare
labelonGuanine
质检合格的RNA
小RNA富集荧光标记(Cy5)
加入样本标记
spikes
KreatechEA-038kit
Nanosep?100K
芯片
杂交
T1C1T1C1
T1C1
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Tiff.file
ArrayList:Gal.file
GPR.file
Axon
Scanner
or
Agilent
Scanner
讯号读取
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GPR.file服务报告产出
均一化
InverientNormalization
差异基因列表
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内容／目的文件类型一文件类型二文件类型三
报告内容
差异基因挑选差异基因列表(excel)直方图(HistogramPlot)火山图(Volcanoplot)
实验分组审视主成份分析(PCA)聚类图(Clustering)
整体讯号分布盒须图(BoxPlot)
报告附件
RNA质量控制RNA质检报告(PDF)
Agilent
Bioanalyzer
Result
芯片质量控制原始图像文件(JPG)原始定量档(GPR)
基因探针批注芯片探针信息(excel)
进阶项目功能分析靶基因预测列表(excel)靶基因功能富集(excel)
表达谱整合分
析(PDF)
(选购)
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(进阶分析项目)
原始数据数据均一化
差异基因的筛选和统计分析
柱
状
图
火
山
图
模
式
识
别
差异基
因分析
靶
基
因
预
测
GO
分
析
Pathway
分
析
整
合
分
析
聚
类
分
析
七个权威的预测软件
(DIANA,miRanda,miRBridge,PicTar,PITA,rna22,
andTargetScan.)及实证靶基因数据库(TarBase,miRecords)
对差异/客户感兴趣的miRNA进行靶基因预测。
取至少3-4个预测关系交集。
透过靶基因关系配对，预测靶
基因富集通路并标示
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MiRNAswhichcouldregulatedownregulatedgenesofthesepathwayswerepredictedbyoneofthe
2algorithmsofDIANA-microTandTargetscan.
IfthesepredictedmiRNAswereamongtheactuallyupregulatedmiRNAs,theyweremarkedinredon
thesepathways.
S6-24
S6-25
33
S6-24
S6-25
34
mRNA&miRNAinteraction
http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl
http://pictar.mdc-berlin.de/
http://www.targetscan.org/
http://www.microrna.org/microrna/home.do
http://diana.cslab.ece.ntua.gr/
http://mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/index.php
http://www.mirbase.org/
常用microRNA靶基因预测数据库
?差异miRNA验证
?miRNA挑选
?miRNAqPCR
?环茎法vspoly-A法
?TaqManvsSYBRGreen
?靶基因确认
?miRNA-mRNA联合分析
?靶基因预测
?miRBase
?TargetScan
?PicTar
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对
照
组
HCV
1
HCV
3
研究中使用的36个丙型
肝炎病毒（HCV）感染患
者血清的临床特征，考虑
年龄/性别；病毒基因型；
和病毒量
HCV1型
(13人)
HCV3型
(23人)
對照組
(15人)
qRT-PCR验证芯片数据：
HCV感染者和正常人血清中miRNA的表达：其中320c,483-5p和134有显著
上调
KEGG通路类别预测的靶基因验证靶基因KEGG通路类别
对研究的miRNAs靶基因预测和验证，这些miRNAs可能涉及HCV感染的发病机制
利用通路分析和miRNA靶基因的网络图找出目标验证基因
蓝/白色显示的基因是不同的miRNA推测的靶基因
到将链接基因最高的节点用色编码
从红到绿分为十个等级，红色为1，绿色为10
HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Neuron,2012
华联生物科技www.onearray.com.cn40
EPAC+/+
EPAC-/-
IN-EPAC-/-
诱导型EPAC缺失
空间能力
记忆能力(隐藏平台水迷宫)
学习能力
社会行为缺陷(社交偏好)Mouse,n=16
神经构造(脑切片)
电生理(EPSC,LTP,LTD)
机转研究
miR-124up,
Zif268(EGR1)down
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与qPCR分析相结合，发现
EPAC-/-小鼠组，许多富集于
脑中的miRNAs发生了显着的
改变，三个较大的上调，三个
较大的下调，在这些miRNAs
中，我们队对miR-124特别关
注，因为其对记忆巩固的突触
功能具有协调功能。
(qPCR，miR-124，成鼠)
为了研究EPAC-/-小鼠miR-
124特定的mRNA靶目标，做
了全基因组基因表达分析，.
经鉴定在EPAC-/-小鼠中发现
有11个基因发生了显着的改
变。
最值得关注的Zif268，也被
称为EGR1，出现了显著的
下调
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?在EPAC-/-中通过敲除miR-124来恢
复LTP和行为缺陷
?构造一种?重组腺相关病毒（的
rAAV1/2）载体来表达miR-124,得
到与EPAC-/-一致的性状
?miR-124的表型，包括LTP的短缺，
空间学习的短缺，和社会行为的短缺
都可以使用LNA-Zif268反义引物，
敲除内源性Zif268来复制。
综上所述，这些结果证明了miR-124转
录是通过控制Zif268的翻译来调节EPAC
对LTP调控，空间学习和社会交往方面
的影响，
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成因：HGPRTase完全缺乏
結果：
a.嘌呤(purine)過多
b.腦性麻痺(cerebralpalsy)
c.自殘(self-mutilation)
遺傳形式：性聯隱性疾病(X-linkedrecessive)
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目標:从mRNA和miRNA基因表现整
合的网络调控关系中找出影响疾病
(有BSS症状的心绞痛病人)可能的
关键因子:芯片实验结果发现23个
miRNA被正向调控(up-regulated)
以及408个基因被负向调控
?优先选择miRNA标的(前百分之五)，从
23个miRNA中挑出了6个。
?将找到的115基因和6个miRNA绘制
成网络图
?找出交互作用频率高的基因(尺寸较大
的圆圈)
?再找一群病人(包含控制组15人、BBS
症状的心绞痛疾病30人以及非BSS症
状的心绞痛疾病30人)做RT-PCR验证
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