上海市教育委员会科研创新项目(No.08YZ62)化瘀祛痰对高尿酸血症大鼠肾脏有机阴离子转运蛋白的作用高建东王毅兴何立群郑平东上海中医药大学附属曙光医院肾病科项目起止年月：2008年1月—2010年12月一、国内外研究的新进展流行病学调查西药治疗肾脏对尿酸盐的排泄过程化瘀祛痰法与尿酸排泄的机制思考课题思路动物实验及分组二、研究工作主要内容各组大鼠尿尿酸及24h尿酸总排泄量的的比较肾组织HE染色光镜下正常组大鼠肾组织结构正常(图1,2)；模型组大鼠偶见局部肾近曲小管上皮细胞肿胀，空泡变性，肾间质充血，炎细胞浸润，肾小球未见明显异常(3,4)；中药组(图5)及苯溴马隆组(图6)肾小球无明显变化，肾间质炎细胞浸润程度减轻，肾近曲小管上皮细胞肿胀及空泡变性减轻。常规透射电镜下观察显示，正常组大鼠肾小管上皮细胞线粒体丰富,呈椭圆或棒形,嵴结构清晰,肾小管上皮微绒毛结构清晰完整,肾小球滤过膜结构完整清晰。（图1,2）模型组可见到部分肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性，线粒体肿胀，表面微绒毛脱失。(图3，4)中药组（图5）及苯溴马隆组（图6）肾小管上皮细胞肿胀和空泡变性减轻，线粒体肿胀减轻，表面微绒毛无脱失。病理结果分析虽然造模后大鼠肾小球形态未见异常，肾功能也未见异常，肾小管功能指标尿β2-MG也未见异常，但造模后肾组织已有轻微损伤，但尚未影响相关生化指标。提示高尿酸血症早期也存在肾组织病理损伤，病变持续发展将可能出现尿酸性肾病的病理阶段，提示单纯性高尿酸血症也应该及早干预以减少病理损害。同时表明化瘀祛痰复方在降低血尿酸的同时还可以改善高尿酸血症模型大鼠肾小管间质病理损害的程度。rOAT1蛋白表达rOAT3蛋白表达rOAT1/rOAT3蛋白表达结论应用酵母粉灌胃合并氧嗪酸钾腹腔注射的方法成功建立了高尿酸血症大鼠模型，更接近于人类原发性高尿酸血症的发病模式，目前该种方法在国内外尚未见报道。该种高尿酸血症模型对于单纯性血尿酸升高的原发性高尿酸血症的研究更为适用。化瘀祛痰复方可降低血尿酸水平并促进尿尿酸的排泄。结论化瘀祛痰可降低血清黄嘌呤氧化酶活性，可能为其降低血尿酸水平的机制之一。化瘀祛痰可上调肾脏尿酸转运蛋白rOAT1、rOAT3的表达，从而促进近端小管对尿酸的分泌而降低血尿酸。也即证实肾脏尿酸代谢调节的机制与中医化瘀祛痰治法相关。为研发治疗高尿酸血症的新药提供了理论依据。敬请提出宝贵意见LOGO健康人血清尿酸值男性150~380μmol/L女性100~300μmol/L原发性高尿酸血症高嘌呤食物饮酒、剧烈运动会一过性上升．在通常饮食下1~2周内重复测定2~3次,若持续超416μmol/L嘌呤代谢紊乱尿酸排泄减少高尿酸血症痛风结石糖尿病高血压冠心病高脂血症肾功能不全终末期肾脏病肾功能进展的独立危险因素寻求新的途径来有效治疗高尿酸血症肾间质明显损害苯溴马隆别嘌呤醇西药肾小球100%滤过大部分在近端肾小管被重吸收少部分又被重新分泌入肾小管腔滤过重吸收分泌原发性高尿酸血症主要病因尿酸排泄减少占90%主要原因重吸收增加分泌减少肾脏有机阴离子转运蛋白OAT1、OAT3在肾小管对尿酸的分泌中起着关键的作用尿酸盐为极性分子，不能自由通过细胞膜，因此其在近曲肾小管的重吸收和分泌过程有赖于离子通道。目前已发现有机阴离子OAT1和OAT3均参与了近曲肾小管对尿酸盐的转运，负责将尿酸从管周毛细血管转运到肾小管上皮细胞内，完成尿酸分泌的第一步。临床及实验研究机制研究思路化瘀祛痰复方临床取得较好疗效何立群教授申请得到了国家知识产权局发明专利车前子利水涤痰留行子通络逐瘀白芥子化痰散结冬葵子活血利水化瘀通络祛痰降浊中医化瘀祛痰法组成的复方可以促进尿酸排泄，推测化瘀祛痰机制与促进肾小管对尿酸的分泌有关。本课题在分子水平证实这一构想OAT1OAT3化瘀祛痰法体内实验目的：以“化瘀祛痰”为治法的中药复方矢志方在有效调节高尿酸血症大鼠尿酸代谢的基础上，探索其促进尿酸排泄的主要分子机制是否通过调控肾脏有机阴离子转运蛋白OAT1、OAT3的蛋白表达而促进肾小管对尿酸的分泌。肾小管对尿酸分泌的分子机制正常组1模型组2中药组3苯溴马隆组4酵母粉灌胃合并氧嗪酸钾腹腔注射两周治疗两周病理状况常规透射电镜血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性OAT1蛋白表达OAT3蛋白表达及酶活性各组生化UA、SCR、BUN、血脂、尿β2MG观察内容肾组织病理HE染色有机阴离子转运蛋白正常组10治疗前64.7±5.4治疗后71.9±13.6模型组7治疗前233.2±23.9☆治疗后267.6±26.3#中药组8治疗前198.9±20.2☆治疗后148.6±10.4△苯溴马隆组7治疗前208.3±14.0☆治疗后153.1±10.8组别nSUA（umol/l）各组大鼠尿酸（SUA）含量（umol/l）的比较☆vs正常组(治疗前),P<0.01；#vs正常组(治疗后)，P<0.01vs模型组(治疗后)，P<0.01；△vs苯溴马隆组(治疗后)，P>0.051.结果正常组1010.0±0.78204.06±17.42.05±0.23模型组713.0±0.65#331.96±9.94#4.31±0.22#中药组816.4±0.56△427.44±23.7△7.03±0.44△苯溴马隆组717.1±0.67426.27±5.477.28±0.25组别n24h尿量(ml)UUA（umol/l）总排泄量（umol/24h）#vs正常组，P<0.01；vs模型组，P<0.01；△vs苯溴马隆组，P>0.05提示化瘀祛痰复方可以有效降低高尿酸血症模型大鼠血尿酸的水平并可促进尿尿酸的排泄。为本课题从肾小管尿酸分泌角度研究化瘀祛痰复方促进尿酸排泄的分子机制奠定基础。结果各组大鼠肾功能（BUN、SCR）含量的比较正常组1054.9±10.545.97±1.36模型组755.4±7.347.00±1.38中药组860.62±12.076.85±0.71苯溴马隆组762.71±15.956.62±0.88组别nSCR（umol/l）BUN(mmol/l)提示该模型属于原发性高尿酸血症早期的病理阶段，未造成肾组织严重损伤，同时提示该种造模方法导致大鼠肾功能异常的时间规律尚值得深入研究。因此该模型尚不能证实化瘀祛痰复方是否对大鼠肾功能具有保护作用。结果各组大鼠血清黄嘌呤氧化酶活力（XOD）的比较#vs正常组，P<0.01；vs模型组，P<0.01；△vs苯溴马隆组，P>0.05正常组1010.27±1.16模型组713.60±0.53#中药组811.56±0.56△苯溴马隆组712.24±0.50组别nXOD（U/l）本实验资料表明化瘀祛痰复方可能是通过抑制XOD的生物合成，从而降低血尿酸的生成；而苯溴马隆组与模型组比较也有统计学差异，目前研究表明苯溴马隆主要是通过抑制近端肾小管对尿酸的重吸收而促进尿酸的排泄，尚无足够证据证明其具有抑制XOD活性的作用，故而其在本实验中对XOD活性的影响尚值得进一步探讨。结果各组大鼠胆固醇（TC）及甘油三脂（TG）含量的比较正常组101.31±0.260.59±0.195模型组71.39±0.310.50±0.95中药组81.34±0.340.46±0.11苯溴马隆组71.49±0.310.47±0.39组别nTC（mmol/l）TG（mmol/l）原发性高尿酸血症导致血脂异常的机制及时间规律尚未明确，本实验结果提示大鼠在造模后血脂水平未伴随血尿酸水平升高而异常。推测是否因该种造模方法时间短暂尚未导致大鼠血脂异常，还是其他原因尚值得更深入的研究。结果各组大鼠尿β2-MG含量的比较正常组1038.66±27.03模型组766.59±36.78中药组849.37±32.92苯溴马隆组736.73±32.58组别nβ2-MG(ug/ml)大鼠经造模用药后，血尿酸增高，但尿β2-MG却未出现明显的升高,而本实验病理结果提示局部偶见肾小管上皮细胞肿胀及炎细胞浸润，推测可能因造模时间短暂，大鼠肾脏代偿功能强大，而未造成对尿β2-MG的影响，但是否影响与小管功能相关的其他指标尚需要进一步深入研究。结果123456×200×6000×200×200各组大鼠rOAT1蛋白表达量的比较#vs正常组，P<0.01；vs模型组，P<0.01；△vs苯溴马隆组，P>0.05正常组10626.97±19.21模型组7293.61±55.60#中药组8512.79±21.17△苯溴马隆组7519.44±21.42组别nArea（UM2）各组大鼠rOAT3蛋白表达量的比较正常组10822.63±18.25模型组7627.38±13.32#中药组8730.50±24.80△苯溴马隆组7725.15±10.73组别nArea（UM2）#vs正常组，P<0.01；vs模型组，P<0.01；△vs苯溴马隆组，P>0.05OAT1(61KD)Actin(43KD)正常组模型组苯溴马隆组中药组正常组模型组苯溴马隆组中药组OAT3(59KD)Actin(43KD)Sheet3
Sheet2
Sheet1
Chart12
正常＋模型actin
正常＋模型OAT1
正常＋模型OAT3
中药＋西药actin
中药＋西药OAT1
中药＋西药OAT3
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中药＋西药OAT1
中药＋西药OAT3
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