甲胎蛋白异质体作为肝癌标志物的临床应用

 

编者按：20世纪 70 年代, Pu rves 发现了甲胎蛋白异质体 (AFP varian t)。之后, 由于某些因素的制约, 迄今尚未广泛应用于临床。 近年来, 许多中外学者对AFP 异质体进行了更为广泛而深入的研究。 本文作者殷正丰教授在收集、综合文献的基础上, 对这一课题的基础理论和临床应用进行了更为深入的研究, 从而论证了AFP 异质体可预警肝癌的发生, 其作为诊断肝癌标志物的主要特点为: 此法不受 AFP>400μg/L作为肝癌诊断标准的限制；不受影像学检查结果为阴性的束缚; 有助于鉴别影像学检查难以确诊的肝占位性病变; 无需动态观察AFP 的含量变化, 从而可缩短肝癌的诊断时间。 更具实用价值的是, 可以借助AFP 异质体与AFP 检测值的对比, 判断患者手术治疗是否彻底, 从而为后续治疗提供重要参考依据。 本文资料新颖, 行文简洁, 方法实用, 现推广于此, 以飨读者。

作者：殷正丰（第二军医大学东方肝胆外科医院分子肿瘤实验室）

关键词: 肝细胞瘤; 甲胎蛋白类; 凝集素类; 肿瘤标志, 生物学

甲胎蛋白 (AFP) 是一个单链糖蛋白。 1970 年Purves 对肝癌病人血清作凝胶电泳时最先观察到AFP有不同的迁移率。随着生物化学及其相关分析技术的进展与应用, 发现 AFP分子与外源性凝集素的亲和力不同, 即存在不均一性的糖链异质性。 后来, 通常将氨基酸序列相同, 而糖链或蛋白质等电点不同的AFP 称为AFP 异质体 (AFP variants)。 通过大量研究, 证实AFP分子糖链异质性与其组织器官来源有关, 不同生理病理状况可产生不同的糖链结构, 并且具有肿瘤特异性。AFP 分子糖链结构与恶性肿瘤关系的确立, 开创了根据蛋白质分子糖链“质”的改变判断疾病的先河, 在实验诊断学领域突破了肿瘤标志物以“量”的异常诊断肿瘤的传统, 有着重要的临床应用价值。

1 AFP 异质体检测方法

自发现AFP 糖链差异以来, 国内外不少学者一直致力于建立各种测定方法, 以期根据AFP 分子质的改变鉴定AFP 的来源。 通过制备针对AFP 不同糖链的单克隆抗体, 建立AFP 糖链异质体直接定量法, 这在理论上似乎是可行的。 然而在实际工作中,由于糖链的抗原性很弱, 难以制备出相应的单克隆抗体, 或制备出的单克隆抗体的特异性难以达到实验要求。 鉴于凝集素能专一地识别并结合某一特定结构的单糖、寡糖或糖链中的糖基序列, 目前国内外仍沿用、发展以凝集素为基础的检测方法。

1.1　凝集素亲和免疫电泳法　将凝集素和琼脂糖均匀混合后制成凝胶板, 血清点样后电泳, 与该凝集素结合的糖蛋白 (包括AFP) 电泳速度降低, 从而与非结合AFP 分离, 再将凝胶板旋转 90°, 作免疫电泳后借助同位素自显影, 最后根据沉淀峰的面积计算结合力不同组分的百分比 (凝集素亲和免疫电泳自显影法)。最近, 我们对这一方法作了改良, 解决了对单一峰型的结果难以判断的问题, 使其更为实用。也可在电泳分离后转移至硝酸纤维膜, 在膜上与AFP 酶标抗体结合, 经显色后测定各个分离带。这种凝集素亲和免疫电泳印迹法国外已有相应的商品化试剂盒。 目前国内外在临床上常采用上述两种方法, 操作简便, 重复性好。

1.2 AFP 异质体比率和 AFP总量同时自动分析法以液相竞争 (AFP 单克隆抗体与AFP异质体结合受到凝集素的竞争抑制) 为基础并与高压液相层析相结合的一种自动化免疫测定系统, 可同时分析AFP异质体比率和AFP总量, 批内误差低于6% , 回收率为 92.6%～ 105.6% , 与凝集素亲和免疫电泳法具有良好的相关性。 目前这一分析系统在日本已进入临床应用。

2 AFP 异质体临床应用

AFP 异质体检测方法的建立, 进一步促进了AFP 基础与临床研究, 大大扩展了AFP 作为肿瘤标志物的临床应用潜能。现已清楚, 不同疾病产生的AFP 在糖链结构上各不相同, 应用不同的凝集素亲和电泳可以把它们分成若干个组分。 迄今已确定了一些可用于测定AFP 糖链异质性的植物凝集素, 如刀豆素A(concanavalin A , Con A )、 E 型红腰豆凝集(phaseo lu s vulgaris agglutin in, PHA-E)、小扁豆凝集素 (lens culinaris agglutin in, LCA ) 或豌豆凝集素 (pisum sativum agglu tin in, PSA ) 等。由于多种限制, 涉及 Con A、 PHA-E 等凝集素的方法并未能得到临床应用。而诊断意义明确、实际应用价值大的是 应用 LCA 或 PSA 测定AFP异质体。 1981 年Breborow icz 等和 Miyazak 等几乎同时报道了 LCA结合型AFP 在肝癌诊断中的价值, 并很快得到大量临床资料的验证。在最初的试验中,AFP 经 LCA 电泳分成 2 个条带。后来随着分离技术的提高, 卵黄囊肿瘤等病人血清AFP 还可分出位于上述 2 个条带之间的另一个条带。 根据3个条带电泳迁移率大小依次取名为AFP-L 1、AFP-L 2 和AFP-L 3, 分别代表 LCA 非结合型、 LCA 弱结合型和 LCA 结合型。20 世纪 80 年代末, 我们发现PSA在AFP 异质体测定中具有与 LCA 完全相同的应用价值 , 从而以自制的、成本较低的 PSA 取代 LCA , 并作为常规项目 一直在本院临床应用。 目前认为, 通常所说的AFP 异质体实际是指与LCA或PSA结合的AFP-L 3 (下同 ) , 早已列入1999年第四届全国肝癌学术会议上通过的原发性肝癌临床诊断标准的肝癌标记物之一。

2.1 AFP 异质体有助于鉴别 AFP 阳性良、恶性肝病，无论采用哪种方法, 国内外研究所得的结果都一致, 即慢性肝病血清AFP 异质体百分比很低, 而原发性肝癌很高, 表明AFP 异质体测定非常有助于良、恶性肝病的鉴别诊断。 目前大多以 15% 作为区分良、恶性肝病的阈值。 新近我们对AFP 低浓度阳性良、恶性肝病的研究表明, 肝癌组血清AFP 异质体均数为 (40.5± 31.2) % , 慢性肝炎组为 (6.4±4.9) % , 肝硬化组为 (6.0± 4.5) %。 而慢性肝炎组、肝硬化组及肝癌组> 15% 的阳性率分别为 4.2%、5.1% 和 84.6% ,差异有极显著性 (P <0.01)。 汇总文献提示，AFP 异质体对肝癌的总敏感性为 50%～60% , 对大肝癌 (≥ 5 cm ) 的敏感性为 80%～ 90% ,特异性为95%以上, 显著高于单纯AFP定量测定。应用AFP异质体鉴别良、恶性肝病应注意以下问题: (1)AFP 异质体上升与血清AFP 值无关, 只要AFP 阳性,AFP 异质体就可能升高。我们在临床检测工作中已发现很多患者血清AFP 为 20～ 50μg/L , 而AFP 异质体呈阳性, 从而使肝癌得到及早诊断。因此,AFP 异质体非常适用于AFP 低浓度阳性良、恶性肝病的鉴别诊断。 (2) 约有 35%～ 45% 小肝癌 (直径< 2 cm ) 病人已显示AFP 异质体显著升高。 因此,AFP异质体对肝癌早期诊断很有价值。(3)AFP 异质体的敏感性和特异性均未达到 100% ,因此存在少数假阳性或假阴性, 尤其是急性肝炎的假阳性率较高。 当然, 急性肝炎在临床上较容易排除。 (4)AFP 阴性以及AFP 含量高并已有影像学检查结果支持 (肝癌特征性占位性病变) 的病人不适合作AFP 异质体测定。

2.2 AFP 异质体有助于预警肝癌发生　 通过对慢性肝病患者的前瞻性研究发现, 在影像学检查发现肝癌特征性占位性病变前数月乃至数年,AFP 异质体就可能随肝细胞癌变而在血中升高。比如, 我们曾对 27 例AFP 20～ 400μg/L、影像学检查阴性、最后确诊为肝癌的病人AFP 异质体含量进行动态观察,发现AFP 异质体升高较影像学检查阳性早出现 3～ 28 个月 ,AFP 异质体阳性预测肝癌发生的正确率为 94%。后来 Sato等报道,AFP 异质体升高的肝硬化病人大多数在 3～ 18 个月内被诊断为肝癌。Shirak i 等对AFP 异质体阳性的肝癌病人进行回顾分析后也发现, 在影像学检查发现肝癌特征性占位性病变前 12 个月就有 41% 的病人AFP 异质体升高。可见, 在影像学检查尚未发现肝癌特征性占位性病变时, 对AFP 低浓度阳性病例进行AFP 异质体检测可以早期预警肝癌发生。

综上所述,AFP 异质体测定用于肝癌定性诊断具有下述优点: (1 ) 不受AFP>400μg/L作为肝癌诊断标准的限制；(2) 不为影像学检查结果为阴性的束缚； (3) 有助于鉴别影像学检查难以确诊的肝占位性病变； (4) 无需动态观察AFP含量变化, 从而缩短从AFP含量升高至肝癌确诊的时间。

2.3 AFP异质体有助于预测肝癌预后Yamashita等随访了55例治疗前AFP 异质体均为阴性的肝癌病人, 其中32 例(58% )在治疗后AFP异质体仍阴性, 23例 (42% )则转为阳性。 阳性组平均生存期显著低于阴性组, 而且AFP 异质体含量与门脉侵犯有关, 阳性组多发性复发与门静脉癌栓形成多于阴性组。如果该指标转为阳性, 肝内遭受侵袭性病变的可能性增加。 另外, Moriwaki 等报道,经根治性外科切除或经皮无水酒精瘤内注射的肝癌病人用维 A 酸治疗后, 在AFP 异质体消失的同时,未见肝癌复发。我们曾随机选择 1991～ 1994 年在本院第一次行肝癌根治性切除术的AFP 阳性肝癌病人作为研究对象, 通过随访有关病例, 收集相关资料, 分析血清AFP 异质体含量与肝癌复发率、生存率的关系, 并进行统计学分析。结果表明 ,AFP 异质体高含量组和低含量组 1、3、5 年累计复发率分别为 32.5% 和 17.4% ; 66.3% 和 45.7% ; 89.2% 和71.7%。高含量组累计复发率明显增高 (P<0.05)。高含量组和低含量组 1、3、5 年累计生存率分别为91.2% 和 97.8% ; 63.8% 和 89.1% ; 38.6% 和65.2%。低含量组生存时间明显延长 (P < 0.01)。最近 Oka 等分析了388例肝癌病人 (来自于9家日本医院) 的临床资料, 发现AFP 异质体与肝癌恶性特征有关, 特别是门脉侵犯和肿瘤分化程度, 而且AFP 异质体>15% 的相关性比 > 10% 更确定, 而AFP 浓度与恶性特征则无关。新近 Yo sh ida 等也报道了类似结果, 认为AFP 异质体是恶性生物学的良好指标, 可作为一个独立的肝癌预后标志物指标。

2.4 AFP 异质体有助于评价肝癌疗效本院对肝癌病人手术后的随访研究表明, 肝癌根治性切除后, 一般在2个月内AFP 转阴,AFP 异质体也随之消失。 如果经一段时间后AFP 虽明显下降但未转阴, 而AFP 异质体变化不明显, 则提示手术不彻底,可能还存在切缘残瘤、血管癌栓、卫星结节或肝外转移等。 这是因为主瘤被切除后, 产生AFP 的主要细胞消失,AFP 绝对值减少,AFP 浓度下降, 但体内尚存在来源于同一克隆的残瘤, 仍在不断产生与主瘤产生的AFP 相同的AFP , 因此AFP 异质体在AFP总量中的比例无明显变化。 另一方面, 如果手术后AFP 异质体随AFP 含量下降而下降, 一段时间后AFP 不能转阴, 而AFP 异质体下降至诊断值以下,以后两值相对恒定, 提示手术可能较为彻底, 而余肝尚存在肝炎或肝硬化。因为在这种情形下, 除了肝癌细胞外, 肝炎或肝硬化亦产生少量糖链异质性不同的AFP。因此, 当肿瘤被切除后,AFP 不能转阴, 但AFP 异质体明显下降。 与上述手术后AFP 下降但AFP 异质体无明显下降的病人相比, 这类病人的短期疗效可能较好。 后来Okuda 等也证实了AFP异质体对评估肝癌外科疗效具有不同于AFP 含量测定的参考价值。

3 AFP 异质体产生的分子机制

据分析, LCA或PSA特异性地识别、结合AFP的分子基础是与肽链232位天门冬酰氨相连的 N乙酰葡糖胺上的岩藻糖。 肝癌型AFP之所以与LCA或PSA结合, 是因为其分子糖链上岩藻糖含量较高。 因此在有些文献中, 用AFP 岩藻糖化指数取代AFP 异质体百分比。 两者其实是同一个概念。至于肝癌型AFP分子糖链改变的机制尚未阐明。与其它糖蛋白一样,AFP 糖链连接与降解过程是在细胞内经糖基转移酶和 (或) 水解酶协同作用形成的。而肝癌细胞发生某种或某些作用于糖链连接与降解的酶代谢障碍, 则可能导致AFP 岩藻糖基化增高。新近Mita 等报道, 肝癌组织α1-6 岩藻糖转移酶活性增高与肝癌形成岩藻糖基化AFP有关。而α1-6岩藻糖转移酶参与的催化反应是将GDP2岩藻糖上的岩藻糖转移至糖蛋白 (如AFP )N-寡糖 N-乙酰氨基葡萄糖残基的还原末断 (通过α1-6 连接)。

来源：中华检验医学网