分子病理在结直肠肿瘤诊疗中的应用

heroiheart 2015-12-29

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导读：目前临床常用的根据肿瘤解剖情况进行分类的TNM分期无法很好的进行组织异质性的分类，从而无法对患者的预后及转归做出准确判断，这就使得结肠癌分子分型成为必要。与传统依赖显微镜下肿瘤细胞形态特征进行的肿瘤分型相比，分子诊断技术的主要区别在于可从分子水平对肿瘤进行更细微、更准确的分析，进而更精准地评估肿瘤的生物学行为和患者预后，最终指导临床个体化治疗。

目前研究发现在结直肠癌患者家族中，约有1/4有癌肿的家族史，其中半数亦为消化道肿瘤。而结直肠癌是在各类肿瘤中与遗传相关尤为密切的一类，在目前的病理临床实践中，单纯依赖形态学进行分级分期的诊断，已经完全无法适应个体化精准医疗的需求了。合理利用分子生物学的手段，进行肿瘤的分子分型，对结直肠肿瘤患者进行用药伴随诊断、预后判断和家族遗传咨询管理，已经成为临床的迫切需求。

分子诊断技术通过检测某些基因的改变可预测发生相关肿瘤的高危人群，尤其有肿瘤家族病史者；或及早发现隐匿性的早期肿瘤患者，及时采取有效的干预措施，可大大提高治愈率，降低死亡率。

香港大学玛丽医院的病理学系就担负着香港地区所有结直肠癌及息肉患者的遗传分析任务，对香港地区的结直肠肿瘤患者及家庭进行遗传咨询服务。

台湾的临床病理工作者也将当地的大样本结直肠癌标本进行了分析，进行22个基因的突变检查，并于微卫星不稳定性与临床预后的相关性进行了分析。认为BRAF基因突变比KRAS直接与更差预后相关（J Surg Oncol. 2014 Sep）。

据我们调查，目前大陆地区仅医学科学院肿瘤医院一家医院的病理科能够提供结直肠癌肿瘤遗传咨询服务。为了更有效的探寻结直肠癌的分子病理驱动机制，准确判断预后并有效指导靶向治疗，医学科学院肿瘤医院病理科应建明教授团队，在2015年连续发表两篇结直肠肿瘤分子病理相关论文：

Colorectal carcinomas with KRAS codon 12mutation are associated with more advanced tumor stages.Li et al. BMC Cancer(2015)

Distinct Clinicopathological Patterns ofMismatch Repair Status in Colorectal Cancer Stratified by KRAS Mutations.Li, etal. PLoS One (2015)

经过多因素大样本相关分析阐述了不同位置的KRAS，BRAF基因的突变及微卫星不稳定性的组合策略分析方法，能够更有效对临床预后及生存期作出判断。并指出KRAS基因突变中，12号编码子的突变比13号编码子突变更直接与肿瘤恶性进展相关。这是我国目前为止最大样本量的临床回顾性研究，对结直肠癌患者管理的临床实践方法提供了非常重要的依据。

分子诊断技术在结直肠肿瘤的病理诊断作用非常重大，下面我们就结合大陆，香港和台湾地区(同为结直肠高发区，且遗传性相近地区)的病理同行在结直肠肿瘤诊断工作中的应用技术做一个简单总结:

用于预测发生结直肠癌的高危患者或早期诊断

2008年，有研究通过检测微卫星的不稳定性和MLH1(49%)、MSH2 (38%)、MSH6(9%)和PMS2(2%)四个错配修复蛋白的表达，对500例结肠癌患者进行Lynch综合征（遗传性部位特异性结直肠癌）的筛查结果表明，这两种方法筛查Lynch综合征的有效率分别为100%和94%。

2015年美国国家癌症综合网络（NCCN）肿瘤学临床实践指南推荐用该诊断技术筛查新诊断结直肠癌患者中的Lynch综合征，据统计每35例新诊断结直肠癌患者中可检出1例Lynch综合征。因此，应用特异性的分子诊断技术可及早发现相应肿瘤的高危人群或第二原发癌并及时给予有效的干预措施，这样可以大大降低癌症的发病率和死亡率。

2. 用于结直肠癌的分子分型

美国犹他州盐湖城犹他大学癌症研究所胃肠病学系N. Jewel Samadder等人在前人的研究基础上利用大样本验证了结直肠癌患者的临床病理特征与结直肠癌分子分型之间的相关性，发现目前提出的检测微卫星的不稳定性分子分型可以发挥判断结直肠癌TNM分期及生存期的作用，但也指出为了验证上述结论仍需要进行更多的临床数据验证。

3. 用于结直肠的肿瘤标志物

目前在结直肠癌诊治中应用最成熟的分子诊断技术是血清CEA及CA199的检测。CEA是大肠癌组织产生的一种糖蛋白，作为抗原可引起患者的免疫反应，可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，它不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。此外，血清CEA水平与结直肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，CEA浓度越高。CA199是一种粘蛋白型的糖类蛋白肿瘤标志物。CEA联合CA199反映出肿瘤存在的可能性，对大肠癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是较好的肿瘤标志物，但其特异性不强，灵敏度不高，对肿瘤早期诊断作用不明显。

4. 用于指导结直肠癌的治疗

化学药物仍然是治疗结直肠癌的重要方式之一。肿瘤化学治疗的目标是通过个体化的治疗方案提高疗效、减少毒性反应。由于个体基因组的差异及肿瘤的异质性，具有相同临床病理特征的不同个体对同一化疗药物或化疗方案的反应性可能不同。对复发患者，经验用药的有效性仅10%～30%。大肠癌有三种主要的内在亚型（A，B，C）。其中，21.5％为A亚型，62.0％为B亚型，16.5％C亚型。C亚型肿瘤患者往往预后最差，是一类间质基因表达的表型，接受氟尿嘧啶（5-FU）的辅助化疗不能带来任何好处。亚型A或B的肿瘤患者有更好的临床预后，有更高的增殖和上皮细胞表型，并能够从5-FU的辅助化疗中获益。

西妥昔单抗是一种人鼠嵌合型免疫球蛋白抗体，能够结合并抑制EGFR。另一种相似的药物帕尼单抗是一种能够抑制EGFR的全人源化的单克隆抗体。主要用于转移性结直肠癌患者的治疗，但很多研究均显示抗EGFR制剂仅对KRAS基因野生型的结直肠癌患者有效，而对携带KRAS基因突变型的患者无效。

2009年NCCN和美国临床肿瘤协会已推荐：所有晚期转移性结直肠癌患者治疗前均应检测KRAS基因状态，将野生型KRAS基因作为选择抗EGFR靶向药物治疗的分子标志物。对于VEGF、EGFR、mTOR和HER2通路抑制剂的有效可耐受剂量，由于毒性叠加或是未知毒性，目前也是较难明确的。只有通过生物预测标志物或者对肿瘤原发性及继发性治疗抵抗机制的明确，我们才能选择出最可能从靶向治疗中获益的患者。所以有效的分子靶标的检测是实现肿瘤患者个体化治疗的必要条件，这样既提高了疗效，又减少了盲目用药给某些药物无效的患者带来的不良反应和经济分担。

5. 用于预测结直肠癌患者的预后

分子诊断技术检测与肿瘤预后相关的标志物可预测肿瘤患者的预后。Siemens等在一项病例对照研究中将94例原发性结直肠癌患者分成实验组（n=47；发生肝转移者，M1）和对照组（n=47；无远处转移者，M0），并检测入组患者肿瘤组织中miR-34a和miR-34b/c启动因子CpG岛的甲基化水平、miR-34a和miR-34a作用靶标（c-MET、Snail和β-catenin）的表达水平。结果显示，miR-34a甲基化（P=0.014）、c-MET（P=0.031）和β-catenin的高表达（P=0.058）均与结直肠癌发生远处转移呈正相关，且在远处转移的肿瘤组织中这3个标志物的出现频率异常高。这提示，同时检测miR-34a甲基化水平、c-MET和β-catenin的表达水平可作为预测结直肠癌患者发生远处转移的指标。

6. APC基因突变与家族性腺瘤性息肉病（FAP）

1986年APC基因首次由Herrera在一位患有直肠肿瘤及智力缺陷的Gardner综合征的患者染色体上发现，该患者的5号染色体长臂上有一段缺失. 随后发现APC基因是FAP的致病基因。

通过检测APC基因突变,可筛选出FAP家族成员高危患者,也可用于评估结直肠癌的疗效和预后,所以检测APC基因变化对预防、早期诊断及早期治疗结直肠癌具有重大意义。检测APC基因突变的方法报道较多，大致分为3类。

第1类：直接序列分析，PCR-SSCP法。检测APC基因高度多态性DNA标记，不必对整个庞大的APC基因所有外显子进行检测.。应用微卫星多态性标记进行LOH分析是目前抑癌基因定位和等位基因丢失研究中最经常采用的方法。 APC基因等位丢失亦常出现在散发性结直肠癌中,LOH发生率为35%～45%。此类方法适合于较小片段基因(100～500 bp)突变的检测，对APC基因需分成40个相互重叠的片段来检测，费时费力。

第2类，包括异源脱氧核糖核酸分子(DNA)分析法(Hdxa)和错配化学清除/羟胺锇酸酐(CCM/HOT)等。一次可检测较大片段的DNA，减少受检片段，如CCM/HOT法使之降到25个片段.。然而，仍要对外显子进行突变检测，需较大片段的序列分析来确定，对APC基因检测也非简便的方法。

第3类，是针对基因突变产生终止密码而表达不全蛋白质(截短蛋白质)来设计的。如体外合成蛋白质试验(IVSP法)和蓝/白选择试验，可以检测大片段的DNA或RNA，又能选择性发现产生终止密码的突变。与蓝/白选择试验不同的是，IVSP法还可根据不全蛋白大小来确定突变的位点。通过对APC基因进行体外合成蛋白质及等位基因特异性表达的测定，可以更有效地检测到不能被PCRSSCP法所检测到的APC基因突变。

总之，由于APC基因突变与FAP早期发生密切相关，且FAP具有较高的遗传倾向，这种疾病如果不加治疗，其恶变率几乎达到100%，所以对APC基因的定位及其功能的研究对于FAP的早期诊断和治疗显得尤为迫切和重要。如果说最初APC基因的发现为FAP的分子诊断学提供了理论基础，目前APC基因的研究进展正使针对这种疾病的分子诊断方法成为可能. 相信通过对APC基因的进一步研究，不仅会有更实用的基因检测诊断方法问世，而且可能得到针对肿瘤发生机制的特异性基因治疗方法。