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03212013 Nature Article Title：Circular RNAs are alarge class of animal RNAs with regulatory potency 文章题目：环状RNA是一大类具有调节功能的动物RNA Abstract Circular RNAs（circRNAs）inanamals are an enigmatic class of RNA with unknown function. To explorecircRNAs systematically, we sequenced and computationally analysed human, mouseand nematode RNA. We detected thousands of well-expressed, stable circRNAs,often showing tissue/developmental-stage-specific expression. Sequence analysisindicate important regulatory functions for circRNAs. We found that a humancircRNA, antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript(CDR1as), is densely bound by microRNA(miRNA) effector complexes and harbours63 conserved binding sites for the ancient miRNA miR-7. Further analysesindicated that CDR1as functions to bind miR-7 in neuronal tissues. Human CDR1asexpression in zebrafish impaired midbrain development, similar to knocking downmiR-7, suggesting that CDR1as is a miRNA antagonist with a miRNA-binding capacityten times higher than any other known transcript. Together, our data provideevidence that circRNAs form a large class of post-transcriptional regulators.Numerous circRNAs form by head-to-tail splicing of exons, suggesting previouslyunrecognized regulatory potential of coding sequences. 摘要 动物体内的环状RNA（circRNA）是谜一样具有未知功能的RNA。为系统研究环状RNA，我们对人，小鼠以及线虫的RNA进行了序列测定和计算机分析。我们检测到了成千种表达很好的稳定的环状RNA，它们通常具有组织或发育阶段的特异性表达。序列分析说明环状RNA具有重要的调控作用。我们发现，一种人类的环状RNA，与小脑变性相关蛋白-1的转录物（CDR1as）呈反义，被大量微RNA（miRNA）效应因子复合物结合，它含有67个可以与古老的微RNAmiR-7结合的位点。进一步的分析指出，CDR1as在神经组织中与miR-7结合。在斑马鱼中表达人的CDR1as会破坏中脑的发育，与miR-7的缺失相似，说明CDR1as是一种miRNA的拮抗剂，其结合miRNA的能力比其他已知的转录物高10倍。综上，我们的数据提供了证据证明环状RNA形成了具有转录后调节功能的一大类物质。大量的环状RNA由外显子头对尾剪接形成，说明以前没有认识到编码序列具有调节功能。 （介绍部分） 成熟信使RNA是带有5’和3’末端的线性分子，两端反映在DNA模板上RNA聚合酶的起始和终止。在细胞中，有时不同的RNA分子通过剪接反应（反式剪接）结合在一起，但是单个RNA分子两个末端通过共价结合形成一个环状RNA是很罕见的。在植物中发现的环状RNA是编码亚病毒感染因子的。在单细胞生物体中，环状RNA往往出自核糖体前体RNA内含子的自我剪接，但也可以在古细菌中通过编码蛋白的基因产生。在不多见的已清楚验证过的动物环状RNA形成中，剪接体似乎在同一个转录物上将外显子5’端与下游3’端连接到一起。也许已知最清楚的环状RNA是从SRY位点（sex-determiningregion Y）转录的mRNA的反义序列，这个环状RNA在睾丸中大量表达。在古细菌和哺乳动物的表达数据的计算机分析结果说明环状RNA比以前预想的要普遍得多，然而还不清楚动物环状RNA是否具有生物学功能。 与环状RNA相比，miRNA得到了深入和充分的研究。miRNA是21个核苷酸长非编码RNA，它会介导效应因子蛋白Argonaute（AGO）到达基因编码的mRNA上抑制蛋白的产生。在人类中，miRNA直接调控大部分具有各种生物功能的mRNA的表达。然而令人惊奇的是，不知道mRNA是否能够逃脱miRNA的调控，如果能的话，又是怎样做的？最近发现了一个以序列特异性方式移除miRNA的机理，这个机理是基于将目标位点做为诱饵或miRNA海绵。带有miRNA结合位点的RNA如果表达量足够的话，会将miRNA从其靶点上移除。然而，所有已报道的哺乳动物miRNA海绵只有一个或两个可以结合同样miRNA的位点而且表达也不高，这样就限制了它们的能力。 为系统确认在动物体内的环状RNA，我们通过筛选RNA-序列数据的方式来寻找环状RNA。与以前的方法相比，我们的计算分析方法可以在任何基因组区域内发现环状RNA，具有长（100个核苷酸）阅读优势，可以预测连接RNA末端的受体和供体的剪接位点。我们不依赖于双向测序（paired-endsequencing）的结果或已知的剪接位点。使用发表过的以及我们自已的测序数据，通过我们的方法在人和小鼠的组织中以及在线虫不同发育阶段发现了数以千计的环状RNA。大量的环状RNA似乎具有组织或发育阶段特异性表达。我们核实了这些数据，发现测试的环状RNA稳定，具有很好的表达，而且在预测的位点进行成环。环状RNA明显在保守核苷酸中富集，说明环状RNA与其他RNA竞争与RNA结合蛋白（RBP）或miRNA的结合。我们综合了生物化学分析，功能性分析的以及计算分析方法，得到了一个人的环状RNA，CDR1反义（CDR1as），它可以作为miR-7的负向调控因子，miR-7是一个从环节动物到人都保守的序列。综上，我们的数据提供了证据说明环状RNA具有转录后调节的重要作用。 环状RNA具有复杂的表达模式 为充分确认在动物中稳定表达的环状RNA，我们在RNA序列读取中筛选剪接点，这些剪接点是由外显子上一个受体5’端剪接点和一个下游的供体3’端剪接点组成（头对尾）（图1a）。由于标准RNA表达信息谱多含有聚腺苷酸化的RNA，我们使用核糖体缺失的RNA的数据（ribominus）以及随机引物。这些数据以前在哺乳动物中用于寻找混杂的外显子。然而这种方法并不是特别设计寻找环状RNA的而且（1）只能用于已存在的外显子-内含子注释，这样错失了从内含子转录的或未注释转录物中的RNA；（2）不能明确认定用于成环的剪接位点；（3）需要假设在双端测序中每对匹配来源于同一个RNA分子。为有一个更客观的方法来寻找环状RNA，我们设计了一个在核糖体缺失的数据中确认线性和环状剪接事件的算法。首先，我们滤出了一直与基因组一致的阅读序列，留下了剪接过的序列。然后，我们对每个待选阅读序列的端区进行不依赖基因组的图谱分析，来寻找唯一的锚定位置。最后，我们要求（1）锚点对比可以延伸到原始阅读序列对比完成；（2）被预测的断点两侧是GU/AG剪接信号。不唯一的图谱以及不明确的断点都被弃用。我们从锚点对比的反向（头到尾）检测到了成环剪接（图1a）。我们的方法也复原了几万个已知的线性剪接事件。我们通过模拟阅读以及对真正测序数据各种不同排列的方法，估算出了敏感度（>75%）和假阳性率（FDR< 0.2%）。然而，对核糖体缺失进行环状RNA的抽提和测序的实验方法效率很低，因此降低了总的敏感度。 我们得到了HEK293（核糖体缺失）的数据并结合了人的白细胞数据，从中检测到1,950个环状RNA，每一个确认至少通过两次独立的跨界阅读完成（图1b）。预测那些能产生环状RNA的基因的表达仅仅有一点点向高表达值移动（补充图1d），说明环状RNA不仅仅是剪接体不常见的错误造成的。我们还在小鼠中确认了1,903个环状RNA（大脑，胚胎脑，诱导分化的胚胎干细胞，补充图1f）；其中的81个与人的环状RNA相同。为查明环状RNA是否存在于动物的其他进化枝中，我们使用了从线虫不同发育阶段得到的测序数据并且检测到了724个环状RNA，每一个确认至少通过两次独立的阅读（图1c）。 大量的环状RNA似乎特异性表达在某种细胞或某个发育阶段中（图1bc，补充图1e）。比如，has-circRNA2149在CD19+白细胞中有13个特殊的跨头尾阅读但在CD34+白细胞，中性粒细胞或HEK293细胞中则检测不到。相似的是，大量的线虫环状RNA似乎只表达在卵母细胞中，而在单或双细胞的胚胎中则没有。 我们使用RefSeq数据库和一个非编码RNA目录表对人的环状RNA进行注释。85%的人环状RNA与已知基因的正义链一致。它们的剪接位点通常跨一到五个外显子（补充图1g），而且与编码外显子重叠（84%），但这种情况中只有65%是两个参与成环的剪接位点都是已知的剪接位点（补充表2），证实了我们所采用方法的优点。所有环状RNA中的10%与已知的转录物的反义相一致，有一小部分与UTRs，内含子以及基因组未注释区相一致（图1d）。人环状RNA的例子如图1e。 我们分析了环状RNA序列的保守性。由于基因组序列是不同程度进化选择的目标，我们研究了三种功能不同亚型的环状RNA。基因间和几个内含子的环状RNA表现温和但在保守的核苷酸中明显增多（补充图1h，i）。为分析含编码序列的环状RNA且这样具有高保守性，我们选择了223个人的环状RNA，它们在小鼠中具有同源环状RNA，而且完全由编码序列组成。对照（线性）外显子是随机挑选的，为与相关的保守性匹配，采用第一个和第二个密码子相同的外显子。带有保守成环性的环状RNA在第三个密码子的位置上要比对照更具有保守性，说明除了在蛋白质水平之外，在核苷酸水平上进化的约束。概括来讲，我们确认了大量的具有复杂表达模式的环状RNA，它们大都但不完全由编码外显子衍生而来。序列的保守性说明至少有一部分环状RNA含有功能性序列组分。  Figure1 Detection, classification andevolutionary conservation of circRNAs. a，Thetermini of junction-spanning reads (anchors) align sequentially to the genomefor linear (top) but in reversed orientation for head-to-tail spliced reads(bottom). Spliced reads must distribute completely to anchors, flanked by AG/GU(Methods). b, c,circRNAs in human cell types (b) and nematode stages (c). d, Genomic origin of human circRNAs.A total of 96% of circRNAs overlap known transcripts. e, Examples of human circRNAs. The AFF1 intronis spliced out (Supplementary Fig. 2e). Sequence conservation: placentalmammals phyloP score (Methods), scale bar, 200 nucleotides. f,A total of 223 human coding sequence circRNAs with mouse orthologues (green)and controls (black) with matched conservation level (inset: mean conservationfor each codon position (grey), controls (black); x axis, codon positions; y axis, placental mammals phyloPscore; see also Methods and Supplementary Fig. 1j, k). Third codon positions aresignificantly more conserved (P,4310210,Mann–Whitney U-test, n5223). 图1 环状RNA的检测，分类以及进化保守性。 a，跨越剪接点的阅读边界与基因组的序列对比，上半部分是线性的，下半部分是反方向头对尾的剪接后阅读。剪接后阅读一定要与锚点对齐，两侧是AG/GU。  b，人体细胞中的环状RNA；c，线虫发育中的环状RNA；d，人环状RNA起源。共有96%的环状RNA与已知转录物重叠。  e，人环状RNA例子。AFF1的内含子已经被剪接掉了（补充图2e）。序列保守性：哺乳动物胎盘phyloP分数。f，共有223个人的编码环状RNA与小鼠有同源物（绿色）和对照（黑色）带有匹配的保守水平（内图显示，每个密码子保守分值的均值，对照是黑色；X轴是密码子位置；Y轴是哺乳动物胎盘phyloP分值，参见补充图1jk）。第三个密码子明显保守得多。 拙评： a是方法示意图，也是这篇文章值钱的地方之一。道理看起来不复杂，就是把一般情况下的mRNA剪接过程掉了个个，结果就成环了。 b和c是韦恩图，分别展示了人和线虫的环状RNA的分布的多样性。严格来说具体的意义不大，比如人的韦恩图，在这里用的是几个代表性很一般的（CD19+，CD34+）的集合，线虫的例子稍微好一点。当然，这幅图的工作量不小，对以后展开某个特定领域的工作帮助会很大。 d是韦恩图，这个也可以叫欧拉图。这个图的实际意义比前两个大得多。本文说的主要是环状RNA，所以在得到的1,602个包含编码的环状RNA中的分布很大程度上决定其意义。注意，在这张图里，作者用的最醒目的颜色是深蓝，就是左上角表示含有反义编码的那部分，虽然只有10%，但它是本文研究的重点。其实如果按照比例的话，重点应该是最大的CDS-exons那一块，占62%，显然更具有代表性，但故事远远不如antisense那样动人。 e是给了几个人的环状RNA的例子，说明了几种情况，没什么大意义。 f是想说明环状RNA的高保守性。这里多说两句，这篇文章还有一个有意思的特点，就是在文章的方法部分往往含有很多结论性的东西，当然原因是多方面的。比如这个环状RNA保守性分析，说服力并不那么强，有些数据不放在正文或图示（图示是正文的一部分）中也许更好。这个图在方法中说的很明白，223个circRNA最后得到的是81个具有保守性，还不到一半。 图1总结，a是核心，d很重要，其他的都是修饰。 关于图1的八卦是b和c；（一定要努力实现八卦最重要的，但a和d实在没什么可说的！)。图1中，b和c采用的是韦恩图，英语叫Venndiagram，由英国人JohnArchibald Venn 创造于十九世纪。其实历史表明，大名鼎鼎的莱布尼茨就早于韦恩使用类似的图来阐述逻辑问题，只不过韦恩让这些图更加著名（也让他自己更加著名乐！） 约翰-韦恩（John Venn，1834-1923）1834年生于英格兰约克郡赫尔市，父亲是亨利-韦恩，母亲是玛莎-赛克斯。小韦恩很不幸，母亲在他三岁的时候就去世了。小韦恩的父亲是一个新教的追随者，一生担任牧师以及其他教职。小韦恩从小被严格培养，希望能够继承父业成为牧师。小韦恩19岁（1853）时入读剑桥大学冈维尔凯斯学院，对现代人来说有几个名人出自这一学院，一个是发现血液循环的威廉-哈维（WilliamHarvey），他比小韦恩要早150年！还有一个现在仍健在的传奇大物理学家霍金，当然他比小韦恩要晚100年！。韦恩1857年毕业，1859年成为牧师，并于1862年回到剑桥成为讲师讲授伦理道德科学。 约翰-韦恩的主要兴趣在逻辑学，他先后发表了几篇这方面的文章。1866年，他发表了“TheLogic of Chance”，在文中他引入了概率中的频率理论；1881年他发表了“Symbolic Logic”，在文中他正式介绍了韦恩图；他还在1889年发表了“ThePrinciples of Empirical Logic”。 1883年，约翰-韦恩被选为皇家学会成员。1923年，约翰-韦恩逝于剑桥。 约翰-韦恩有一个儿子，名字也叫约翰-韦恩，是英国经济学家，并担任很长时间的剑桥大学女王学院院长。  上面是约翰-韦恩的照片，看上去非常严肃，想象中逻辑学家就应该是这个样子。下面是那个著名的彩色玻璃窗。  在剑桥大学Caius 学院的彩色玻璃窗上有为了纪念约翰-韦恩而制作的图案，他从1903年起一直担任Caius学院的院长直到逝世。 韦恩图是用于显示元素集合重叠区域的图示。它既可以表示一个独立的集合，也可以表示集合与集合之间的相互关系。最常见的是三元韦恩图，上过美术课就一定会记住。  这个图表示了三个集合之间可能的所有组合。那么四个集合就是文章中所用的椭圆形式了：  注意到了么？在三元韦恩图中最大的不同集合数是7；在四元中这个数是15；在五元中这个数是多少，为什么？ 韦恩图也创造了数学问题，最著名的是对称问题，就是满足什么样条件的韦恩图是对称的呢？答案是质数元素的韦恩图是对称的。来个n=5 看看：  看着没那么复杂，不过你可以知道，直到今天，还常常可以见到有关韦恩图的数学问题讨论发表在顶级学术杂志上。好了，我们回来看文章！ 50个预测的环状RNA的特性 通过实验在HEK293细胞中验证我们对环状RNA的预测。反转录后通过实时PCR检测头对尾的剪接，使用不同引物进行Sanger序列测定（图2ab）。在环状RNA随机选择的23个剪接位点中19个得到了验证（83%），说明了我们方法的准确性高（表1）。相反，在白细胞中预测的7个环状RNA中有5个在HEK293中检测不到，说明了环状RNA表达的特异性。 头对尾的剪接也可能由反式剪接或基因组重排产生。为排除这些可能性以及可能产生的PCR人工产物，我们成功地通过RNaseR验证了人的环状RNA的非敏感性，RNaseR是一种降解线性RNA分子的核酸外切酶，我们通过NorthernBlot，采用跨头对尾剪接位点的探针，验证了RNaseR对人的环状RNA没有降解作用（图2c）。我们定量测定了21个环状RNA对RNaseR的抗性，而且通过qPCR验证了头对尾的剪接。所有测量的环状RNA至少比GAPDH对RNaseR的抗性高10倍（图2d，补充图2a）。我们推测环状RNA应该比mRNA正常情况下翻转慢得多。确实，我们发现在阻止转录24小时后环状RNA仍然非常稳定，稳定程度超过内参基因GAPDH（图2e，补充图2b）。在小鼠的脑组织中，我们也验证了与人同源的小鼠的环状RNA（3/3）。在线虫中，从生殖细胞和早期胚胎中预测的20个环状RNA有15个在混合的样品中得到了验证（补充图2d，补充表3）。  Figure 2 | CircRNAs are stable transcripts with robustexpression. a, Human(hsa) ZRANB1 circRNA exemplifies the validationstrategy. Convergent (divergent) primers detect total (circular) RNAs. Sanger sequencing confirms head-to-tail splicing. b, Divergent primers amplify circRNAs in cDNA but not genomic DNA(gDNA). GAPDH, linear control, size marker in base pairs. c, Northern blots of mock (2) and RNase R (1) treated HEK293 total RNA with head-to-tial specific probes for circRNAs. GAPDH, linear control. d,e, circRNAs are at least 10-fold more RNase R resistant than GAPDH mRNA (d) and stable after 24 h transcription block (e) (qCPR; error bars indicate standard deviation). 图2 环状RNA具有稳定的转录物和表达 a，人的ZRANB1 环状RNA验证策略示范图。收敛（扩散）引物探测到整个环状RNAs。Sanger测序证实头对尾的剪接。b，扩散引物在cDNA中扩增环状RNA，不扩增基因组DNA（gDNA）。GAPDH是线性对照。  c，Northern Blot, GAPDH 作为对照。d，e，环状RNA比GAPDHmRNA 对RNaseR的抗性至少高10倍。 图2总评：工作量及技术含量都不大，属于过渡阶段数据，没有太多值得讨论的地方。 环状RNA CDR1as 与AGO蛋白密集地结合 带有多个miRNA结合位点的稳定的转录物可以以“miRNA海绵”的方式起作用。我们把环状RNA的目录与转录物的注释结合起来分析，并假设成熟环状RNA中没有内含子。我们筛选与保守miRNA家族种子匹配的保守序列。（在方法中作者介绍了具体的做法，就是将环状RNA作为靶序列，普查有哪些已知的miRNA可以与其作用。一个假定的miRNA靶点是一个6个核苷酸长的序列，这个序列与成熟的miRNA上第2到第7位的序列呈反式互补。同时补充说明，通常情况下称之为保守的。）当对同一个miRNA家族进行保守匹配计数时，与编码序列或3’端UTR序列相比环状RNA明显富集（P<2.96 X 10 -22, n = 3,873; P < 2.76 X 10 -21, n =3,182; Mann-Whitney U-test）。 作为一个极端的例子，我们发现已知的人的环状CDR1as 上具有许多保守的miR-7的种子匹配（即结合位点）。为检测CDR1as是否与miRNA结合，我们分析了miRNA效应子AGO蛋白的生物化学，在整个转录组范围的结合位点数据。我们对人的AGO作了四次独立的PAR-CLIP（photoactivatable-ribonucleoside-enhancedcrosslinking and immunoprecipitation）实验，而且将结果与发表过的数据相结合。PAR-CLIP 主要基于通过紫外将RNA与蛋白交联，然后对结合到特异的RNA结合蛋白上的RNA进行测序。在大量高密度的AGOPAR-CLIP的读数中，长度为1.5kb的CDR1as 基因位点脱颖而出（图3a），而其他九个合并的检测其他RNA结合蛋白库的读数基本不存在。需要注意，CDR1基因正义编码的转录物没有产生PAR-CLIP读数，这个转录物起初是从类肿瘤性小脑变性（paraneoplasticcerebellar degeneration）患者体内以自抗体的攻击目标验证出来的。 对于32个脊椎动物的序列分析发现，miR-7是具有保守种子匹配的唯一的动物miRNA，这样可以解释AGO与CDR1as转录物的结合。人的CDR1as包含74个miR-7种子匹配，其中的63个至少在一种其他生物中存在。不同位点间的保守性很小，说明miR-7的结合位点可能具有功能性（图3b）。对预测的环状RNA-miRNA复合物的二级结构分析表明种子外miR-7减少的碱基配对（图3c）。32种脊椎动物序列中有大约1500个miR-7的互补位点，但在miR-7位置12以外则没有一个互补位点的存在（只有三个可以形成一个11个核苷酸的双层复合物）（补充表4）。哺乳动物Argonaute蛋白的切割需要10和11位的互补，而且依赖12位以外的延伸互补。这样，CDR1as似乎正好可以大量结合miR-7而又不被miR-7所切割。 单分子成像技术展示了分散的，大多数情况下处于细胞质中的CDR1as的表达（HEK293细胞中），这与它miRNA海绵功能相一致（图3d，补充表5）。通过NorthernBlot 检验了CDR1as的成环性（图3e）。缺口实验证实了环状CDR1as可以被线性化而且会被降解（补充图5a）。在HEK293细胞的RNA中，除了环状CDR1as外没有检测到线性的CDR1as（补充图5b）。对环状RNA的表达水平进行了定量测定，方法是实时PCR，使用发散性引物，通过标准曲线法进行定量（补充表6）。CDR1as表达量很高（15-20%对GAPDH的表达，图3f）。通过HEK293RNA-seq 的数据，估算GAPDHmRNA的拷贝数（大约每个细胞1400个分子）可以知道每个细胞中CDR1as可能最多结合20,000个miR-7分子。 如果CDR1as的功能是miR-7的海绵，那么它的破坏将会引发miR-7目标的表达下调。我们在HEK293细胞中敲除了CDR1as，然后检测发表过的miR-7目标基因的表达，使用的方法是实时定量PCR，采用外部尖刺的标准。所有的八个miR-7的目标基因都下调了，内参基因也都下调了。另外，微串（nanostring）技术证实有许多基因下调了。还有，通过病毒引入小发夹RNA的方法稳定减少CDR1as的表达引起体外创伤修复中细胞迁移的明显减少（补充图5阿附，补充表7）。这样，敲除CDR1as会影响HEK293细胞，但我们无法说明这是miR-7的特异性作用，因为它可能是非直接的，或者是不依赖于miR-7的CDR1as的功能。  Figure 3 | The circRNA CDR1as is bound by the miRNAeffector protein AGO, and is cytoplasmic. a, CDR1as is densely bound by AGO (red) but not by unrelatedproteins (black). Blue boxes indicate miR-7 seed matches. nt, nucleotides. b, c, miR-7 sites display reducednucleotide variability across 32 vertebrate genomes (b) and high base-pairing probability within seed matches (c). 图3 环状CDR1as与miRNA效应子蛋白AGO结合，环状CDR1as存在于细胞质中。 a，CDR1as密集地与AGO（红色）结合，但不与不相关蛋白（黑色）结合。蓝色区域是miR-7种子匹配区。b，c，在32种脊椎动物基因组中miR-7位点展示减少的核苷酸可变性（b）；以及在种子匹配中碱基的高配性（c）。  d, CDR1as RNA is cytoplasmic and disperse (whitespots; singlemolecule RNA FISH; maximum intensity merges of Z-stacks). siSCR, positive; siRNA1, negative control. Blue,nuclei (DAPI); scale bar, 5 mm (see also Supplementary Fig. 10for uncropped images). e, Northern blotting detects circularbut not linear CDR1as in HEK293 RNA. Total, HEK293 RNA; circular, head-to-tail probe; circ1lin, probe within splice sites; IVTlin., in vitro transcribed, linear CDR1as RNA. f, Circular CDR1as is highly expressed (qPCR, error bars indicate standard deviation). g, CDR1as. Blue, seed matches; darderd, AGO PAR-CLIP reads; bright red, cross linked nucleotide conversions. d，CDR1asRNA 是处于细胞质中分散的。（白点；单分子RNAFISH） e，NorthernBlot 在HEK293细胞RNA中检测到环状CDR1as但没有线性CDR1as。 f，环状CDR1as是高度表达的。 g，CDR1as 示意图。蓝色，种子匹配；暗红，AGOPAR-CLIP阅读；鲜红，交联的核苷酸形式。 图3评论： 图3主要展示CDR1as的性质，说明它在细胞质中的存在情况。值得注意的是其中采用了单分子成像技术。由其性质，文中强调的与miR-7结合的特点，引出下面有关的功能上的内容。 CDR1as与miR-7在脑组织中的共表达 如果CDR1as确实与miR-7具有相互作用，那么它们一定是共表达存在的。miR-7在神经组织，胰腺和脑垂体中具有很高的表达水平。HEK293可能是一种从胚胎肾中神经细胞前体衍生的细胞系，除此之外，我们定量分析了CDR1as和miR-7在不同的小鼠组织以及胰岛分化的MIN6细胞中 的表达情况（图4a）。CDR1as和miR-7在脑组织中都具有高表达水平，但CDR1as在非神经组织中表达很低或没有表达，包括miR-7高表达的其他组织。qPCR数据说明CDR1as仅仅在成年和胚胎的小鼠脑组织中是呈环状的（补充图5gh）。这样，CDR1as与miR-7似乎在神经组织中特异性地进行相互作用。确实，通过原位杂交方法，我们在胚胎小鼠（E13.5）的脑组织中发现CDR1as和miR-7具有相似但不完全相同的表达模式（图4b）。非常特异地，CDR1as和miR-7在发育的中脑区域具有共同高表达的特点。因此，CDR1as是高表达的，稳定的，存在于细胞质中的，不呈线性存在而且与miR-7共享表达结构域的环状RNA分子。这些性质再加上CDR1as中存在的miR-7结合位点，说明CDR1as是神经组织中可能的环状的miR-7的海绵。  Figure 4 | CDR1as and miR-7 have overlapping and specificexpression in neuronal tissues. a,Among mouse tissues and MIN6 cells (qPCR, relative to cerebral cortexexpression; error bars indicate standard deviations; see Supplementary Fig. 9afor miR-122 control) neuronal tissues co-express miR-7 and CDR1as. b, Insitu staining of CDR1asand miR-7 in mouse embryo brain E13.5 (U6 and miR-124, positive control;scrambled probe, negative control). Scale bar, 1mm. 图4 CDR1as与miR-7在神经组织中具有重叠和特异性的表达。 a，小鼠组织以及MIN6细胞中CDR1as和miR-7的共表达情况，qPCR数据（以大脑皮层的表达为参照）。b，小鼠胚胎（E13.5）脑的CDR1as和miR-7的原位杂交图。 图4总结： 图4进一步强调了CDR1as的性质，即在组织中的表达分布，工作量很大。另外要注意到的一个细节是miR-7在Colon中具有很高的表达，但CDR1as则没有，说明在Colon中有类似CDR1as的其他功能分子的存在。还有在cortex和hippocampus中CDR1as的表达都远远高于miR-7，说明CDR1as可能还有其他的功能。 miR-7 和CDR1as在斑马鱼中的作用 如果在动物模型中敲除CDR1as则会提供很多信息。然而，这种敲除将会影响到CDR1蛋白，那样的结果是未知的。如果使用斑马鱼做动物模型则可以克服这个问题。根据我们的生物信息学分析，斑马鱼的cdr1的位点是缺失的，而miR-7却在胚胎脑组织中高度表达。因此，我们可以检测是否miR-7会产生一种功能失去的表型，能否使用引入哺乳动物CDR1asRNA的方法来诱导这种功能缺失表型的发生。在使用9ng剂量的miR-7吗啉代时，胚胎并没有整体上的形态缺失变化，但分别在两种不同的，独立的遗传背景下可以重复性地产生脑发育缺陷现象（图5ab）。特别是，70%的样本清晰一致地具有中脑体积减少的现象，另外还有5%的样本完全失去了中脑。需要说明的是，处于大脑前侧的端脑（encephalon）的体积并没有受到影响。通过共聚焦三维堆积方法对整个大脑的体积也都作了测量（图5c，补充图7）。中脑体积的减少与其他动物miR-7被抑制的现象时一致的（补充图6d）。这些数据说明miR-7功能缺失导致中脑体积的减少。 为检测CDR1as是否在体内可以像miR-7的海绵样具有功能，我们在斑马鱼的胚胎中注射两种质粒，一种是可以表达线性CDR1as的，另一种是可以在人细胞中表达环状CDR1as的（图5de）。qPCR确定在斑马鱼中表达了环状CDR1as，而这些鱼可重复性地发生了中脑体积减少的现象（图5gh）。同样，在小鼠中注射体外转录的部分小鼠CDR1asRNA但不是从另一条链上来的RNA可以明显减少中脑的体积（补充图6gi）。因此这一表型是由CDR1asRNA引起的，而不是非特异性RNA或DNA注射引起的。这些结果提供证据说明人/小鼠CDR1as转录物在体内是具有生物活性的，可以产生像miR-7被抑制那样的对脑发育的损伤。中脑体积的减少可以通过注射miR-7前体部分恢复（图5fg），说明CDR1as表达的生物学效应至少部分由其与miR-7的相互作用而产生。  Figure 5 | In zebrafish, knockdown of miR-7 or expressionof CDR1as causes midbrain defects. a, b, Neuronal reporter (Tg(huC:egfp)) embryos (top, light microscopy) 48h post fertilization (bottom, representative confocal z-stack projections; blue dashed line, telencephalon (TC)(control); yellow dashed line, midbrain (MB)). Embryos after injection of 9 ngmiR-7 morpholino (MO) (b) display a reduction in midbrainsize. Panel a shows a representative embryoinjected with 15 ng control morpholino. c,Threedimensional volumetric reconstructions. d,Emptyvector control. e, Expression vector encoding human circular CDR1as. f, Rescue experiment with miR-7 precursor. g, Phenotype penetrance (% of embryos, miR-7 MO, n=135; uninjected, n=83; empty vector, n=91; linear CDR1as, n=258; circular CDR1as, n=153; circular CDR1as plus miR-7 precursor, n=217). phenotype distribution derived from at least three indepenent experiments. Scale bar, 0.1mm. ** P<0.01; ***P<0.001 in Student t-test for normal midbrain, reduced midbrain (see also Supplementary Fig.6). h, Phenotype quantification (Methods). Error bars indicate standard deviation n=3 per group. 图5 斑马鱼中通过CDR1as敲除miR-7导致中脑缺陷。 a，b，受精48小时后胚胎神经元报道基因代表性共聚焦z-轴堆积成像；蓝色虚线，端脑（对照）；黄色虚线，中脑。注射9ngmiR-7 吗啉代（morpholino,MO）（b）显示中脑体积减少。组图a表示注射15ng对照吗啉代。c，三维体积重建。d，空质粒对照；e，表达人环状CDR1as；f，恢复实验，采用miR-7前体；g，表型外显率（胚胎%，miR-5MO，n=135；未注射，n=83；空质粒，n=91；线性CDR1as，n=258；环状CDR1as，n=153；环状CDR1as+miR-7前体，n=217）。h，表型定量统计。 图5总结： 这是本文第二卖点，相当于做了一个knock-out鼠之后发现它是 lethal的，算是很大的发现。图很一般，就是要说明环状CDR1as的功能，作为miR-7的海绵，作用结果使中脑发育缺陷。值得注意的是，由于表型决定了CDR1as功能的重要性，也就决定了这篇文章的重要性，因此对于表型的鉴定还是很认真地，算了一下，总共统计中有937个zebrafish的胚胎处理，工作量还是很大的。 讨论 我们已经显示了在动物基因组不同位置有几千个环状RNA的表达（比如，从编码和非编码外显子中，基因间区域或转录反义到5’和3’UTRs），它们的表达呈复杂的组织特异，细胞类型特异，或是发育阶段特异的方式。我们提供的证据说明CDR1as在脑组织中通过与miR-7的结合而充当转录后调解物的作用：（1）CDR1as 密集地与miRNA效应因子分子结合；（2）CDR1as含有74个miR-7种子匹配位点，大多高度保守；（3）CDR1as呈高表达，稳定存在于细胞质中；（4）CDR1as与miR-7在小鼠胚胎脑组织中共享特异性表达区域；（5）人/小鼠的CDR1as在体内呈环状形式，线性物检测不到；（6）人/小鼠的CDR1as注射到斑马鱼中会在脑中出现与miR-7敲除相似的表型。也许斑马鱼对人的CDR1as的成环作用不完全，但与线性CDR1as相比较，中脑的表型还是很明显的。虽然两种DNA质粒携带的是同一个启动子，以相同的剂量进行注射，我们仍然不能排除中脑发育缺陷是由其他因素引起的可能。但是由于CDR1as或环状RNA异常的稳定性，我们的数据说明环状RNA可以用作miRNA或RBP的抑制剂。以后的研究应该阐明CDR1as如何线性化然后靶定目标进行降解的。miR-671可以诱导CDR1as的降解，因此CDR1as可能的功能是将miR-7带到亚细胞区域，在那里miR-671可以促进其释放miR-7。已知的miR-7目标比如PAK1和FAK1的功能支持这种想法。 在斑马鱼中由于CDR1as表达引起的表型通过表达miR-7只能部分地恢复，说明CDR1as的功能不只是捕获miR-7。这一想法得到的实验支持是在成年小鼠脑海马部位原位杂交显示只有CDR1而没有miR-7的信号（补充图9b）。那么环状RNA除了成为海绵之外还可能有什么功能呢？作为单链RNA，CDR1as可能，比如，与目标mRNA的反式3’UTRs结合来调节其表达。甚至可能miR-7与CDR1as的结合是为沉默这些反式作用活动。还有，CDR1as可能与大的RNA或蛋白质复合物的组装相关，也许与其他低复杂性分子具有相似性。 还有多少个其他环状RNA存在呢？在本研究中，我们通过序列数据确认了人有2,000；小鼠有1,900；线虫有700个环状RNA；而且我们通过实验确证了最常见的50个。然而我们只是通过一些具有局限性的简易手段检测了几个组织/发育阶段的情况。因此，真正的环状RNA的数量要大得多。尽管CDR1as是一个极端的例子，但许多环状RNA都具有保守的种子匹配。比如，SRY位点产生的环状RNA具有小鼠miRNA的种子位点。因此，环状RNA可能与其他RNA竞争与miRNA的结合。序列分析表明当编码外显子表达环状RNA时，它就承担了额外的可能的调节功能，而基因间或内含子产生的环状RNA则通常只显示弱保守性。由于我们检测了成千的环状RNA，因此会有趣地推测到外显子随机的成环作用很容易得到进化，而且可能为得到稳定的表达良好的具有调节功能的RNA的快速进化提供一个机理。还要提醒的是，我们在人的环状RNA中检测到了许多病毒miRNA的种子匹配。然而，没有理由认为环状RNA的主要功能一定是与miRNA结合。比如像在细菌中，miRNA海绵的捕获机制对RBP同样重要。同样，环状RNA可以存储，分类或找到RBP。概括来说，我们的数据说明环状RNA形成了一类转录后调节物，它们可以和其他RNA竞争与miRNA和RBP的结合，通常情况下的功能是调节局部的RBP，RNA或其位点的浓度。 另注：本文审阅过程中，成纤维细胞中环状RNA被发现。 (正文完) 当期专家评论： Title: Circlesreshape the RNA world 题目：圆圈重塑RNA世界 Abstract Theversatility of RNA seems limitless. The latest surprise comes from circularRNAs, which are found to counteract the function of another class of regulatoryRNA –the microRNAs. 摘要 RNA的多样性似乎没有边界。最新的惊奇来自环状RNA，发现它可以反作用于另一种调节性RNA-微RNA。 （正文） 信使RNA编码蛋白的功能可以被短的microRNA序列的结合而抑制。但microRNA诱导的抑制作用自身又是如何被抑制的一直不得而知。在本期中，Memczak等（333页）以及Hansen等（384页）描述了高度稳定的环状RNA通过结合几个拷贝的microRNA而终止microRNA抑制mRNA作用的过程。 报道的环状RNA（circRNA）有被Memczak称为CDR1as以及被Hanse称为ciRS-7的，包含可以与microRNA-7（miR-7）结合的大约70个结合位点的高度保守序列，并可以与AGO蛋白形成复合物。后一个环状RNA是RNA诱导沉默复合物的一部分，这个复合物使miRNA可以识别其目标mRNA。当Memczak与同事将人的CDR1as/ciRS-7表达在斑马鱼的胚胎中时，其效果与减少miR-7的表达时见到的一样-破坏了中脑的发育。还有，作者的生物信息预测指出在基因组中有几千个环状RNA的存在，这与之前的报道相一致。 miRNA所进行的目标抑制是一个有微妙之处的过程。一方面，miRNA上的这些序列可以诱导AGO-介导，通过mRNA与miRNA之间序列互补性激活的，在mRNA第10,11位核苷酸上的内切性核酸酶对mRNA的切割。在目标mRNA被切割后，miRNA被释放，重新以催化方式去与下一个目标结合。另一方面，miRNA可以通过化学计量的方式与目标mRNA结合得更紧密，这样miRNA就可以抑制蛋白的翻译。这种方式使目标mRNA变成了一个储存miRNA的“水库”，阻止miRNA进一步抑制其他mRNA。后一种机理说明了竞争性内源RNA（ceRNA）的作用方式。竞争性内源RNA（ceRNA）是一些mRNA，它们与其他mRNA一起分享miRNA-应答组份（MREs），因此与其它mRNA竞争性地与miRNA结合。 象内源性RNA一样，环状RNA也可以起miRNA水库的作用。然而由于环状RNA对于特异miRNA具有很多结合位点，因此其作用完全是为miRNA提供庇护所。内源性RNA与miRNA的结合不仅阻止了miRNA与其他MREs的结合，同时也可以抑制内援性RNA编码部分的翻译。这样，与环状RNA相比，内源性RNA以相对复杂的相互作用分子的方式限制翻译的进行。在特殊分子中也存在其他位点的水库。这些包括目标模拟物比如在植物拟南芥中的基因IPS1对于假基因PTENP1的诱饵作用，还有可能是与其相关蛋白编码序列分开的3’端mRNA未翻译区。 环状RNA通过消除RNA外切酶的活性来增加自身的稳定性，通常RNA外切酶在RNA分子自由3’或5’端开始进行切割。还有，由于一个环状RNA上有几个作为拮抗单一miRNA的结合位点，因此一个环状RNA就可以一下子从不同目标上抓到许多miRNA。同样，环状RNA的解体也可以一下子释放出很多miRNA，而这些miRNA会去寻找具有共同MRE的mRNA作为目标。事实上，Hansen等大致画出了环状RNA解体的机理，miR-671与互补性更强的CDR1as/ciRS-7结合而不是miR-7，导致AGO-介导对这一环状RNA的切割。 对miRNA进行快照法资料分析发现，miRNA的表达在发育，细胞分化或肿瘤形成的过渡点时期发生很大的变化。在这些过渡点阶段，可以通过环状RNA的方式清除mRNA-miRNA复合物而用另一种不同的miRNA代替。比如，作为一种蛮不讲理的方法来清除miRNA时，当细胞从干细胞开始进行分化时环状RNA增加表达，这样可以捕获在干细胞中过量表达的miRNA。环状RNA也可以清除成熟miRNA的另一条链，那条链可能以令人惊奇的数量存在；或者环状RNA可能具有治疗的功能，将癌症相关的miRNA从促进癌症形成的途径上移除。然而在所有这些情况中，环状RNA捕获miRNA，但miRNA是如何被解离得仍不得而知。 为了以最佳方式运转，每个环状RNA上大量的miRNA结合位点也许是在进化选择的压力下为了从其目标位点上进攻几乎所有某种特异的miRNA。如果情况真的如此，那么一个细胞中某种环状RNA上miRNA结合位点的数量与这种环状RNA的拷贝数的乘积将告诉我们某一个特异性miRNAMRE的总强调。许多miRNA在每个细胞中大约的拷贝数是103-大致上是将其完全清除所需环状RNA位点数的下界。然而，如果环状RNA要在与mRNA竞争miRNA的结合中取得胜利，它们就需要有比mRNA更强的与miRNA的亲和力。高亲和力可以通过热动力学的方式建立在环状RNA序列中，但还需要细胞中与其它相关性MREs总量相关的过量的环状RNA编码的miRNA的结合位点。确实，模型制作者将很快在这个领域中到处可见。 维护大致21个核苷酸长的miRNA没有改变在经过主要进化包括环形RNA后（图1）。对于每一个miRNA的选择压力无疑很高：一个miRNA的序列一定要自我成对形成发夹式miRNA前体；它一定要与目标mRNA配对；它也一定要与终结或调节目标相互结合的位点配对。虽然有大量的可能miRNA序列，miRNA数量上的改变很小，说明在剩余的进化空间中革新受到限制，换句话说，miRNA达到了分子的完美。在整个动物进化过程中，自然采用一套相对稳定的编码基因，而miRNA的革新，通常来讲，更离不开全新的序列的创造。也许发夹式miRNA前体轻而易举地以有效调节因素的方式出现-而且“数字式地”适合大量的基因组非编码序列，包括环状RNA-这种因素可能会成为进化的驱动者。 作为补充说明，我们需要一个更好的环状RNA的命名系统。“ciRS-7”说明它与miR-7结合，因此假设这类其他的环状RNA也会清除地对应一个miRNA。“CDR1as”假设这个环状RNA将与一个命名了的基因有某些联系-在这种情况下，是一个小脑变性相关基因的反义序列。基因组中有几千个这样的环状RNA，它们需要自己的编号系统，我建议把这个叫做circR-1。 Figure 1 | Constraints on evolutionary change in microRNAs. MicroRNAs (miRNAs) liein a fitness valley constrained by their numerous interactions, which includethose with the hairpin structure of the precursor miRNA (pre-miRNA), the many targetmRNAs and other RNAs that terminate or modulate miRNA binding to targetsequences by competing against them. The latter category includes competingendogenous RNAs (ceRNAs), pseudogene decoys and miRNA mimics. Two studies1,2 introduce circular RNAs(circRNAs) as another constraining factor. MRE, miRNA-response element. 图1 microRNA 进化改变的限制。miRNA处于健身谷中，被大量的相互作用限制在那里，这些限制性的相互作用包括带有发夹结构的miRNA前体，许多目标mRNA和其他通过竞争来终结或调节miRNA与目标序列的结合的RNA。后面这类包括竞争性内源RNA（ceRNA），假基因诱饵以及miRNA模拟物。 （图中说明的是miRNA在进化过程中的各方面压力，因为评论的文章中侧重环状RNA对miRNA的作用，因此评论直接用miRNA的进化来说明。图本身很漂亮，属于比较fancy的那种。） （全文完）
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